核苷磷酸化酶_参环毛蚓体内核苷磷酸化酶的活性测定及动力学分析

参环毛蚓体内核苷磷酸化酶的活性测定及动力学分析

1材料与方法 1.1仪器及试剂 P680A LPG 高效液相色谱系统、ASI-100 自动进样器、 UVD170U 紫外检测器，美国戴安公司;TL-18M 台式高速冷冻离心机，上海市离 心机械研究所有限公司;TG16-W 微量高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有 限公司;SG8200HE 超声波清洗机，郑州南北仪器设备有限公司;BP211D 十万分 之一精密电子天平，德国赛多利斯公司。

1.2实验动物 样本采自广东省广州市番禺区，经广州中医药大学李薇教授 鉴定为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima asperfillum(E.Perrier)。选择体型健硕、活力 较强、性成熟、体表具有明显生殖环带、平均湿质量约 14.1 g 的健康成蚓，经 无菌超纯水清洗后，放入铺有湿润灭菌滤纸的塑料箱中，在室温(222)℃下，避 光培养 48 h 以备用。

1.3标准溶液配制与样品处理 1.3.1标准溶液配制 精密称取肌苷标品 3.88 mg，次黄嘌呤标品 2.51 mg， 分别置于 2 mL 量杯中，用 PBS缓冲液溶解并定容至 10 mL 的容量瓶，均稀释 为 500滋molL-1作为母液，置于 4 ℃冰箱中备用。

1.3.2参环毛蚓粗蛋白的制备 解剖活体参环毛蚓，去除肠道后剪取体壁组织用 PBS 缓冲液浸泡润洗 3次，转移至培养皿剪碎后用匀浆器研磨，以 0.1 molL-1pH7.4 的 PBS 缓冲液为溶剂，将组织液转移至离心管，4℃ 12000 rmin-1 离心 30 min，将提取液分装，-20 ℃保存备用。以小牛血清蛋白(BSA)为标准品， 采用 Bradford 法测定粗蛋白含量。

1.4色谱条件 采用 Ecosil C18-AQ 柱 (250 mm4.6mm，5滋m)，流速为 0.8 mLmin-1，柱温为室温，检测波长为 254 nm。流动相 A 为 10 mmolL-1磷酸二 氢铵缓冲液，用磷酸调 pH 至 4.5，B 为 10 %甲醇。采用梯度洗脱：0～10 min A-B(50∶50)，10～15 minA-B (20∶80)，15～25 min A-B (0∶100)，25～35min A-B(0∶100)。

2结果 2.1方法学考察结果 2.1.1方法专属性 在优化的色谱条件下，肌苷峰型良好，与代谢产物分离 良好。

2.1.2标准曲线的绘制与检测限 取次黄嘌呤标准液，用 PBS 缓冲液稀释 成 0.5，2，4，5，10，15，20，40滋molL-1的系列标准液，取 10滋L 按色谱条 件进行 HPLC 分析，测定次黄嘌呤含量(n=5)。以次黄嘌呤峰面积Y为纵坐标， 次黄嘌呤浓度(X，滋molL-1)为横坐标，绘制标准曲线。结果表明次黄嘌呤在 0.5~40滋molL-1浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y=0.0653X-0.0394， r=0.9996。次黄嘌呤检测限为 0.05滋molL-1(S/N3)。

2.2肌苷在参环毛蚓组织粗蛋白中的酶反应动力学 2.2.1蛋白浓度考察 为了考察参环毛蚓体壁组织酶反应体系中合适的蛋白 浓度，以不同蛋白浓度(X)与产物次黄嘌呤的浓度增加量绘制曲线。结果表明样 品的蛋白浓度在 0～7.5 mgmL-1范围内，与产物浓度变化量呈线性关系，因此在 该浓度范围内的广地龙粗蛋白提取物可用于酶活性分析。

2.2.2孵育时间考察 为了考察适当的的孵育时间，以产物浓度与孵育时间 绘制曲线，结果见图 3。在0～30 min 的反应时间内，酶促反应呈线性上升，而 30 min 后，酶活力基本稳定，说明酶促反应已完成，处于稳定状态，故选用孵 育时间 30 min 作为酶活力测定的时间。3讨论 在酶活性的检测方法中，高效液相色谱法因其灵敏度高、选择性好而应用 广泛，尤其是对目标成分的检测能做到快速、准确、实时的特点，更受国内外学 者的欢迎。本研究参考了文献有关 HPLC 方法，并以此为基础对流动相的比例、 梯度洗脱条件进行了改进及优化，实现了底物与产物之间的良好分离。

对酶活性的测定是通过检测单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的 增加量来实现的，即测定酶反应的速度。而酶反应速率受蛋白浓度和反应时间影 响，只有当反应速率与蛋白浓度及孵育时间均显线性关系时，才是酶活性的真实 表现。因此，本研究考察了酶反应体系所需的最佳蛋白浓度和孵育时间。首次建 立了参环毛蚓体内次黄嘌呤代谢酶活性测定相关的实验体系，为进一步研究平喘 有效物质的代谢途径及其调控机制提供了良好的实验平台。

鉴于国外有研究学者已从寄生虫和哺乳类动物体内发现 PNP 是主导次 黄嘌呤生成的关键酶。因此，本研究选取了 PNP 作为研究对象。此外，与嘌呤 合成代谢途径相关的酶还有腺苷脱氧酶(ADA)和黄嘌呤氧化酶(XO)。本实验除了 PNP 外，还利用上述实验体系对 ADA 和 XO 也进行了酶活性分析，获得相应 的动力学参数。此研究结果与国外已报道的人红细胞、寄生虫等嘌呤合成代谢途 径关键酶活性的结果颇为一致。由此，提示参环毛蚓体内有可能也存在类似嘌呤 合成代谢途径。