胃癌细胞中DPC4基因失活与启动子区的突变|失活基因

胃癌细胞中DPC4基因失活与启动子区的突变

【关键词】 dpc4 胃癌 启动子 突变 0 引言 胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居消化道肿瘤的首位 [1]。目前，随着分子病理学的发展，许多基因，如tp53、k²ras、c²erbb2、k²sam、 e²cadherin (cdh1)和pten，已被发现与胃癌的发生和发展过程密切相关[2²3]。

Www.133229.CoM然而，研究表明这些基因的改变并不能完全说明胃癌的演进过 程，与胃癌相关的且未被阐明的分子事件还很多。最近，有文献报道，位于18 号染色体的dpc4（deleted in pancreatic carcinoma 4,dpc4）基因可能在胃癌的发生 发展过程中扮演着非常重要的角色[4]。

dpc4基因所编码的蛋白（smad4）是tgf²β（transforming growth factor²β， tgf²β）信号通路中的一个重要的成员。smad4蛋白在细胞浆内与磷酸化的受体型 smad蛋白, 即smad2 和 smad3，形成异源三聚体复合物，然后从胞浆穿梭入细胞 核。此复合物在细胞核内作为转录因子调节tgf²β靶基因的表达，其中包括细胞周 期蛋白依赖的激酶抑制基因（cyclin²dependent kinase inhibitors）p15 (ink4b) 和 p21 (waf1)[5²6]，从而抑制了细胞周期的进程。因此，当dpc4失活或表达下调时 就会促进肿瘤的发生和发展。本课题组前期实验结果表明dpc4基因的失活与胃癌 密切相关，且其失活可能是由多种因素共同作用的结果[7]。zhou等[8]报道dpc4 基因启动子区域的突变可能是导致dpc4在子宫内膜癌中失活的原因之一，然而对 于胃癌细胞中是否存在dpc4启动子区域的突变至今还未见报道，为此，我们研究了9种胃癌细胞系中dpc4基因启动子区域的突变情况，并分析了dpc4突变与基因 表达之间的关系。

1 材料与方法 1.1 细胞培养 在所研究的9种胃癌细胞系中包括6种低分化的细胞系（snu5、snu16、 snu216、snu484、snu638、ags）、2种中等分化的细胞系（mkn28和mkn74）和一 种印戒细胞癌的细胞系（katoⅲ），所有细胞均由韩国首尔大学药学院申英基教 授馈赠。snu5和snu16 细胞为悬浮生长的细胞系，其余为贴壁生长的细胞系。细 胞接种在含10%胎牛血清、2mm谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的 rpmi²1640培养液中，在37℃，5% co2环境下培养。

1.2 核酸提取 采用基因组dna提取试剂盒（qiagen, germany）来提取9种传接5代以内的 细胞系基因组dna，所有的操作步骤完全参照试剂盒说明书的进行。提取的dna 首先要经过琼脂糖凝胶电泳来检测是否有降解成分，合格的再经过紫外分光光度 计检测其含量和质量，od值260nm/280nm在1.8到2.0之间的为质量合格。此外， 我们用trizol（invitrogen, usa）试剂从细胞系中提取rna，然后利用superscriptⅱ转 录酶、寡核苷酸²dt以及随机引物与rna共孵育来进行反转录。整个操作过程完全 按照产品说明书执行。

1.3 反转录聚合酶链反应 (reverse transcription pcr, rt²pcr) 采用rt²pcr的方法来检测9种胃癌细胞系中dpc4基因在rna水平的表达情 况。具体的引物序列如下：正义引物5′²atg gac aat atg tct att a²3′，反义引物5′²gtc taa agg ttg tgg gtc²3′，其扩增片断为dpc4基因编码区cdna的全长。pcr反应的条件是：
94℃变性5min，紧接着28个循环的94℃变性30sec，60℃退火45sec和72℃延伸 90sec，最后是72℃10min延伸步骤。pcr反应混合物的成分包括：1×缓冲液，1.5mm mgcl2，10pmol双向引物，0.2mm dntp，1u taqdna聚合酶，cdna和相应的双蒸水， 反应混合物的总体积为50μl，阴性对照为无模版的pcr反应。最后利用浓度为1% 的琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）对pcr产物进行电泳。所获得的凝胶图像用alaphaimager 2200凝胶分析软件进行分析。

1.4 pcr扩增和测序 为了检测胃癌细胞中dpc4基因启动子区的突变情况，我们对9种胃癌细 胞系的该区域进行了pcr扩增。具体的引物序列如下：正义引物5′²cca ggg gta aga gaa cac ca²3′，反义引物5′²gac atg gcg cgg tta cct²3′，其扩增片断长度为1438bp。pcr 反应的条件是：94℃变性5min，紧接着40个循环的94℃变性30sec，60℃退火45sec 和72℃延伸60sec，最后是72℃10min延伸步骤。pcr反应混合物的成分同上，模板 为100ng 基因组dna，反应混合物的总体积为50μl。扩增产物首先经过1%琼脂糖 凝胶电泳来检测是否有正确条带产生，然后利用试剂盒纯化扩增产物，再将产物 克隆到pgemt质粒，提取质粒后，送到公司进行测序。

2 结果 2.1 dpc4在胃癌细胞中的表达 我们运用rt²pcr的方法对9种胃癌细胞系中的dpc4表达水平进行了检测， gapdh基因作为内参。结果显示，dpc4在snu5、snu16、snu484、snu638和katoⅲ 细胞中表达较高，而在snu216、mkn28、mkn74 和 ags细胞中表达较低或缺失， 见图1。说明dpc4基因失活在胃癌中是一种频繁发生的分子事件。

图1 dpc4在胃癌细胞中的表达情况（略） fig 1 expression of dpc4 in gastric cancer cells 2.2 胃癌细胞中dpc4启动子区域的突变情况 为了阐明dpc4在胃癌细胞中的下调机制，我们应用pcr扩增及测序的方 法对9种胃癌细胞系中的dpc4启动子区的突变状态进行了检测。pcr结果显示在所 有的9种细胞系中都出现了特异性的条带，这表明在启动子区域没有大片段的插 入或缺失突变。测序结果表明，在mkn74细胞的启动子区域出现了两处碱基置换 突变，突变位点一个在距离转录起始位点上游38bp处（正义链g→c 或反义链 c→g）见图2a，另一个突变位点在转录起始位点上游481bp处（正义链t→c或反义 链a→g）见图2b，而在其它8种细胞系中没有发现dpc4启动子区域突变。↓:signify mutation point 图2 mkn74细胞中dpc4启动子区域的突变情况（略） fig 2 promoter region mutation of dpc4 gene in mkn74 cell 2.3 dpc4启动子区域的分析 为了探讨这些置换突变的意义，我们又利用tfsearch ver.1.3（japan）等 软件对dpc4启动子区域进行了分析。分析结果显示，在dpc4启动子区域含有多个 转录因子结合位点，这包括aml²1a、maz、 sp1、lef²1、hnf²3、 mzf²1和ik²2，见 图3，而在mkn74细胞的两个突变恰好发生在转录因子mzf²1和ik²2的结合位点上， 这提示两个碱基置换突变可能通过干扰转录因子的结合而影响dpc4基因的转录。

3 讨论 dpc4基因是一种经典的肿瘤抑制基因，已有研究表明dpc4基因的失活与 多种肿瘤的发生发展密切相关[9]，然而对其失活机制至今还没有被完全阐明。

本课题组前期研究表明在胃癌中dpc4基因启动子区域的甲基化、染色体的杂合性 缺失以及编码区突变都是导致其基因失活的原因之一，但这三种遗传和表观遗传 的机制并不能完全解释dpc4基因在胃癌中的失活，因为仍有一些胃癌组织在没有 发生上述三种现象的同时却发生了基因失活现象[7]，这提示还有其他的机制参 与了dpc4基因的失活。

zhou 等［8］研究发现在子宫内膜癌中dpc4基因启动子区域出现了置换 突变，且其突变导致dpc4基因的失活，这一研究结果促使我们去探讨是否在胃癌 中也发生了类似的现象，即启动子区域的突变也是导致胃癌细胞dpc4基因失活的 原因。我们首先对9种胃癌细胞系中的dpc4的表达水平进行了研究，rt²pcr结果显 示dpc4基因在胃癌细胞中频繁发生缺失或表达下调，这一结果与之前的报道基本 一致。随后，为了探讨其失活机制我们对dpc4基因启动子区域进行了克隆和测序。

我们发现在9种细胞中只有一种，即mkn74，在dpc4启动子区域发生了突变，突 变的类型为置换突变，突变点一个位于距离转录起始位点上游38bp处（正义链 g→c 或翻译链c→g），另一个突变位点在转录起始位点上游481bp处（正义链t→c 或反义链a→g），而在mkn74细胞中的dpc4基因恰好发生表达下调，这提示启动 子区域的突变可能是导致mkn74失活的机制。↓：signify mutation point；
▼：signify transcription start site；
ø: signify transcription factor binding site 图3 dpc4启动子区域分析（略） fig 3 analysis of dpc4 promoter region 为了更深入的了解dpc4基因启动子区域突变与失活的关系，我们对启 动子区域的转录因子结合位点进行了分析。结果显示，在dpc4启动子区域含有 aml²1a、maz、sp1、lef²1、hnf²3、mzf²1和ik²2等多个转录因子结合位点，而两个 置换突变恰好发生在mzf²1和ik²2两个转录因子的结合位点上。mzf²1是一种c2h2 锌指蛋白转录因子，研究发现此分子可调节细胞增殖和分化，并参与肿瘤形成[10]。

而转录因子ik²2被发现可调节淋巴细胞分化，并可转录激活胰岛素调节的氨基肽 酶（irap）和胎盘亮氨酸氨基肽酶（p²lap）等基因[11]。因此，发生在两个位点 的置换突变可能会影响转录因子mzf²1和ik²2与dpc4启动子的结合，继而干扰了转 录因子的转录激活作用，最终导致dpc4基因的失活。

总之，本研究首次发现了胃癌细胞中存在着dpc4启动子区域的突变，且 其突变可能是导致dpc4失活的原因之一。然而对于两个置换突变的真正意义还有 待于进一步研究阐释。