实时荧光定量PCR在肝炎检测中的应用 实时荧光定量pcr

实时荧光定量PCR在肝炎检测中的应用

关键词：实时荧光定量；
PCR；
乙型肝炎 肝炎是全球人类健康的最大威胁，全球感染乙型肝炎（乙肝）约有4亿人， 而我国的感染率更高约为9.09%，感染者超过1亿[1]。病毒通过对机体免疫系统 及感染肝细胞的攻击，引发肝炎和肝细胞坏死，若控制不及时、有效就会引发肝 硬化、肝癌。因此，对肝炎进行及时有效的检测，准确掌握病毒复制情况及肝炎 治疗进展，具有非常重要的意义。传统检测肝炎的酶联免疫吸附试验虽能够检测 病毒的感染和传染性，却无法反应乙肝病毒（HBV）的复制水平，而实时荧光定 量PCR可以根据基因水平（DNA）来判断乙肝病毒的复制状况，帮助临床诊断乙 肝感染水平和疗效。广东省深圳市药品检验所通过对血清学标志不同的乙肝患者 的血清进行检测，以了解不同血清模式的患者中乙肝病毒复制水平。

1 资料与方法 1.1 一般资料：2008年10月～2010年4月我院共接诊急、慢性乙肝患者450 例，其中男230例，女220例，年龄15～58岁，平均（40.9±21.1）岁，入院诊断符 合《病毒性肝炎防治方案》（2000年）[2]。经酶联免疫吸附试验对乙肝患者的 血清进行检测，并按血清学标志分为三组：A组中HBsAg、HBeAg及抗HBc呈现 阳性；
B组中HBsAg及抗HBc、抗HBe呈现阳性；
C组中HBsAg及抗HBc呈现阳性。

三组中抗HBs均为阴性。

1.2 实时荧光定量PCR检测方法：采用上海复星HBV DNA（乙肝病毒基 因）定量检测试剂盒及ABI7300美国荧光定量PCR分析仪进行检测。采集患者1.5 ml静脉血，注入无菌离心管中并在室温下放置2 h后再在低温4℃下静置1 h，然后 实施5 min的8 000 r/min离心，吸取血清200 μl放入另一无菌离心试管，提取DNA、 进行PCR分析。若每毫升拷贝达5.0×102及以上即为阳性。1.3 统计学方法：对每组HBV DNA阳性数和阳性率进行统计，并采用μ检 验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 不同血清学标志模式的实时荧光定量PCR检测阳性率分别为A组95.95%、 B组31.47%、C组52.20%，三组之间差异均有统计学意义（P＜0.01）。具体HBV DNA含量结果见表1。

表1 不同血清模式组中HBV DNA含量及阳性率对比[例（%）] 3 讨论 实时荧光定量PCR检测具有较高的特异性和灵敏度，可多重反应并且拥有 准确、实时、无污染的特点，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因检 测等研究中。不仅可以对病毒定性，还可以准确、快速的对病毒核酸进行定量， 进而能够对病毒数量在疾病治疗过程中的消长规律进行研究，并可治疗效果及可 能出现耐药性进行评估。

HBV DNA标志着病毒复制的存在，与肝病传染和活动相关，本组研究中 其A组阳性率达95.95%，与相关文献报道相似，并且比B、C组明显高出很多， 同时A组组内患者血清的HBV DNA也有较大差异，有69.05%超出5.0×104拷贝/ml， 表示乙肝病毒正处于复制活跃期。B组复制数据降低，但仍有31.47%的患者血清 HBV DNA含量≥5.0×104拷贝/ml，证明病毒DNA复制没有停止。C组是HBsAg病 毒携带者或急性肝炎患者，阳性率明显比B组高，比A组低。B、C组乙肝病毒复 制处于非活跃状态。实时荧光栋梁PCR检测可以对病毒携带者地传染性及携带水 平进行直接有效的反应，是乙肝病毒传染性、复制活动性及携带量检测的可靠性 指标，可以为乙肝病毒感染诊断、治疗及预后判断提供客观依据。

本组研究中A组中HBV未达到理论上的100%，可能部分病患治疗后乙肝 病毒复制受到抑制或发生变异产生假阴性有关，但血清学标志却可以仍表达为阳 性[3]。说明PCR仅能够检测复制的病毒，对于病毒非复制感染不能有效检测，因 而不可在肝炎检测中完全替代血清标志物检测。