前列腺素脱氢酶对大肠癌SW480细胞恶性增殖的抑制_前列腺素A

前列腺素脱氢酶对大肠癌SW480细胞恶性增殖的抑制

western blot检测p53、p21蛋白表达改变情况。结果 转染表达pgdh后,细胞增殖受 到抑制，实验组平板集落形成率为16% ，而对照组为58% ，两者间差异显著 (p0.05)；
肿瘤细胞的停泊  非依赖能力降低，实验组软琼脂克隆体积小且形成个 数(7±1.68)明显少于对照组(16.3±3.63)，差异显著(p0.05)。western blot分析表明， 转染表达pgdh后伴随着p53、p21蛋白表达升高。结论 转染表达pgdh蛋白能够部 分逆转大肠癌sw480细胞的恶性表型,其过程可能与p53、p21通路密切相关。

【关键词】 大肠癌 pgdh 转染 细胞生长 p53 分子遗传学在人类肿瘤研究领域中的应用,使人们认识到有一类基因在控 制细胞生长、增殖及分化过程中起着重要的负调控作用,并能潜在地抑制肿瘤的 生长。这类基因的特点是：一是该基因在正常组织中表达;二是恶性肿瘤组织中 功能失活、结构改变或表达缺陷；
三是将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤 细胞内,可部分或全部逆转其恶性表型[1] 。wWW.133229.cOM近年研究表明, 15  羟基前列腺素脱氢酶(15  hydroxyprostaglandin dehydrogenase, pgdh)具备类 似上述的特征,如mrna及蛋白在大肠粘膜及多种正常组织中表达，但在大肠癌组 织中表达下调[2,3] ;
肺腺癌a549细胞转染表达pgdh后,裸鼠致肿瘤能力明显降低 [4]；
转染pgdh能够诱导乳腺癌细胞凋亡[5]等。大肠癌中pgdh的抑癌作用及可能 的机制国内尚无报道，对pgdh的进一步研究不仅对探索肿瘤发生发展的分子生物 学机制具有重要意义,并能够为肿瘤的诊断和治疗提供实验及理论的积累。

1 材料和方法 1.1 主要试剂 trizol、rpmi1640、lipofectamintm购自invitrogen公司；
mtt、细胞用琼脂粉 购自sigma公司；
限制性内切酶、反转录pcr试剂盒购自takara公司；
大肠癌细胞株 sw480购自上海细胞库；
pgdh单克隆抗体购自cayman公司；
p53、p21单克隆抗体 及hrp标记二抗购自santa cruz公司；
ecl检测试剂购自amersham公司；
其他均为国 产分析纯试剂。1.2 方法 1.2.1 重组质粒的构建 利用trizol提取正常人大肠粘膜组织总rna，通过反 转录pcr扩增pgdh编码框。合成5′端含hind ⅲ (上游)和bamh ⅰ(下游)酶切位点的 引物( f1：5′  aag ctt ctg cac cat gca cgt ga 3′；
f2：5′  gcg gat cct tca gct atg gct aac  3′）。再将载体pcdna3.1和pgdh的pcr产物分别于37℃，bamh ⅰ和hind ⅲ酶 切,回收产物经t4连接酶16℃连接20h，然后转化感受态dh5α，阳性克隆命名为 pcdna3.1  pgdh，经pcr、双酶切和测序验证。

1.2.2 细胞培养和基因转染 sw480大肠癌细胞在5%co2、37℃、饱和湿度 条件下培养于含10%已灭活的胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的 rpmi1640培养基中。收获对数生长期的细胞(细胞数约5×106)接种于60mm培养皿， 待细胞密度长至90%时，参照lipofectamintm2000试剂操作指南分别用 pcdna3.1  pgdh和pcdna3.1质粒转染细胞，获得sw480/pcdna3.1  pgdh (实验组)及 sw480/pcdna3.1(对照组)细胞。

1.2.3 细胞生长曲线 取转染24小时后的细胞，分别以1×104个/ml细胞浓度 接种于96 孔板，置培养箱，24小时后每孔加20μl mtt (5mg/ml)，4小时后加入二 甲基五枫100μl，室温振荡10min，应用酶联免疫测定仪，测波长490nm吸光度值， 每天计数，每组细胞10孔，连续检测6天，绘制细胞生长曲线。

1.2.4 细胞平板集落形成实验 取转染24小时后的细胞200个接种于6孔板。

5%co2、37℃、饱和湿度条件下培养14天，可见细胞集落时终止培养。常规pbs 漂洗，甲醇固定10min，0.4%结晶紫染色10min。实验重复3次,显微镜下计数大于 50个细胞的集落数,取平均值。集落形成率=集落数/接种细胞数×100%。

1.2.5 软琼脂集落形成实验 将0.7%琼脂糖和1.2%的琼脂粉灭菌处理后， 当温度降至40℃时，按1∶1比例与2×rpmi1640 (含双倍血清和抗生素)混合成为上 层和下层培基，加1.5ml下层培养基于6孔板凝固后，将约2 000个细胞与1.5ml上 层培养基混合,加到已凝固的底层琼脂上。5%co2、37℃、饱和湿度条件下培养20 天，于倒置显微镜下观察。实验重复3次，镜下(×40)随机挑选10个视野计数细胞 克隆数。

1.2.6 流式细胞仪检测 1×105个/ml的细胞悬液，用pbs洗涤2次，700ml/l 冷乙醇固定，dapi染色，上样于流式细胞仪进行细胞周期检测，计算各周期百分比。

1.2.7 western blot检测 western blot检测pgdh、及p53、p21蛋白水平的变化， β  actin作为对照。收获转染48小时的细胞(约1×106)于200μl细胞裂解液中，冰上 裂解30min，4℃、12 000g离心10min，收集上清，用bradford法定量。取50μg样 品与等体积的2×上样缓冲液混匀，100℃煮沸5min，12% sds  聚丙烯酰胺凝胶 (page)分离蛋白。半干式电转移至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉室温封闭2h，加 入封闭液1∶1 000稀释的pgdh、p53、p21及β  actin多抗，4℃过夜；
pbs  t洗3 次，每次5min；
加hrp标记的二抗，室温反应2h，pbs  t洗3次，每次5min；
ecl 发光，x线胶片曝光。

1.3 统计学方法 采用spss11.0统计软件对计量资料进行student′s t检验分析，计数资料进行 χ2检验。p0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 pcdna3.1  pgdh真核表达质粒的构建和鉴定 采用基因重组技术构建了pcdna3.1  pgdh质粒, pcr及酶切后送菌液测序, 正确的质粒用于下一步实验，见图1。

2.2 pgdh基因对sw480细胞形态学的影响 转染表达pgdh后，细胞形态发生变化，对照组细胞呈卵圆形、多边形、贴 壁叠堆状生长,胞浆均匀透亮;而实验组细胞叠堆状或多层明显减少,细胞间相互 分散,出现梭形细胞,胞体变长,胞浆透亮度下降,颗粒感增强,部分细胞皱缩、细胞 胞体回缩变圆或脱落呈悬浮状,并出现细胞碎片，见图2。

2.3 pgdh对肿瘤细胞增殖能力的抑制 从图3的3种细胞生长曲线可见, 实验组sw480/pcdna3.1  pgdh细胞的生长 速度明显下降，而对照组sw480/pcdna3.1生长曲线在三天后呈现持续升高的趋势， 与未转染的sw480细胞生长能力相似。

平板集落实验中,接种细胞一周后,可以见到对照组已有散在的细胞集落形 成,而实验组集落偶见；
14天后，与对照组相比,实验组细胞克隆个数少而且体积较小，见图4。计数发现，实验组细胞集落形成率为16%，对照组为58%，两者 差异有统计学意义(p0.05)。进一步分析显示，pgdh对sw480细胞的集落形成抑制 率为82.3%。结果表明pgdh可以抑制肿瘤细胞增殖。

2.4 流式细胞仪检测细胞周期 实验组细胞g1期平均值153.4，占86.8%；
g2期平均值292.4，占5.7%；
s期 占7.5%；
g2/g1为1.863。对照组细胞g1期平均值146.5，占62.8%；
s期占19.9%；

g2期平均值281.1，占16.6%。比较后可见, 实验组静止期细胞所占比例增加，dna 合成期所占细胞比例减少，表明细胞转染表达pgdh后分裂增殖能力被抑制。

2.5 pgdh对肿瘤细胞悬浮非依赖能力的抑制 软琼脂集落形成实验是检测肿瘤细胞悬浮非依赖能力的重要手段,实验发 现,在接种细胞第10天时,对照组出现高倍镜下(×100)明显可见的细胞克隆,而实验 组偶见小的克隆;第14天时,两组克隆虽然增多、增大,但与对照组相比,实验组的克 隆数目少，克隆体积小，见图5。计数后显示，实验组每视野平均克隆个数为 （7±1.68）；
对照组为（16.3±3.63），两组差异有显著的统计学意义(p0.01) 。

2.6 western blot检测结果 sw480细胞没有内源性pgdh蛋白表达, 转染pcdna3.1  pgdh质粒48h后在细 胞裂解液中可以检测到pgdh蛋白。与转染空载体细胞相比，p53、p21蛋白表达明 显升高，见图6。提示p53途径可能与pgdh抑制肿瘤细胞恶性增殖有关。

3 讨论 大肠癌的发病率和死亡率在全世界呈逐年上升趋势[6]。大肠癌发生发展 是多基因参与、多步骤及多阶段的分子事件模式，如 dna甲基化水平变化，ras 激活myc扩增，p53和apc突变等[7，8]，这些基因仍不足以解释肿瘤的发生、发 展的全过程。前列腺素（prostaglandin，pg）合成的重要限速酶——环氧合酶 (cox)  2 参与肿瘤的发生和发展过程，pgdh作为pgs的降解酶，可降解pge2，对 cox  2亦有天然拮抗作用。最近有研究显示在结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和 甲状腺髓样癌中pgdh表达缺失或减少，其表达缺失或减少乃至其生物活性的降低 是肿瘤发生的早期事件，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。但是pgdh在大肠 癌中如何发挥作用机制尚不清楚。无限增殖和凋亡受阻是肿瘤细胞的重要特征，抑制肿瘤细胞增殖和诱导其 凋亡是治疗肿瘤的理想方法。本研究发现大肠癌sw480细胞转染表达pgdh后，细 胞叠堆状或多层明显减少，细胞间相互分散，出现梭形细胞，胞体变长，胞浆透 亮度下降，颗粒感增强，部分细胞皱缩、细胞胞体回缩变圆或脱落呈悬浮状，并 出现细胞碎片，提示pgdh基因转染干扰了人大肠癌细胞的正常生长。细胞生长曲 线表明转染pgdh基因抑制了sw480细胞的增殖能力。平板集落形成实验14天后观 察发现，与空载体转染组相比，细胞克隆个数少而且体积较小。实验组细胞集落 形成率为16%，对照组细胞集落形成率为58%，经比较，差异有统计学意义（p0.05）， 两组相比，pgdh基因集落抑制率为82.3%。说明pgdh基因转染降低了人大肠癌 sw480细胞的集落形成能力，对sw480细胞的增殖有抑制作用，并且阻滞于g1期。

软琼脂克隆形成实验是测试细胞恶性程度的重要指标。肿瘤细胞丧失了接触抑制， 而且可达到高于正常细胞的密度，甚至形成多层细胞，肿瘤细胞丧失“着壁”生长 特性，不依赖固体基质，能在半固体琼脂糖培养基中形成细胞集落，也称停泊  非依赖性。我们通过双层软琼脂培养发现， pgdh基因转染后软琼脂克隆形成慢， 个数少而且体积小，提示pgdh部分逆转了sw480细胞的恶性表型。通过western blot 检测进一步发现，转染pgdh基因后伴随着p53、p21蛋白表达升高。提示pgdh基因 可能是通过p53、p21通路发挥作用。

肿瘤细胞的恶性增殖是肿瘤生存和侵袭转移的前提条件，pgdh基因能够抑 制癌细胞的增殖，可以降低癌细胞的恶性程度，通过对其具体作用机制的深入研 究，pgdh基因有望作为一种基因药物应用于临床。