阿霉素诱导鼻咽癌细胞凋亡的机制研究|如何诱导细胞凋亡

阿霉素诱导鼻咽癌细胞凋亡的机制研究

细胞凋亡早期出现的细胞容积减小称为凋亡性细胞皱缩 (apoptoticvolumedecrease,AVD),是具有普遍性意义的细胞凋亡早期的标志性事件。

我们实验室前期研究表明，氯通道参与过氧化氢诱导的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12 细胞凋亡[6]、紫杉醇[7]和丹参酮[8]诱导的低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞的凋亡。这 些结果提示多种抗肿瘤药物都可能通过激活氯通道引起AVD,继而诱导细胞发生 凋亡，从而发挥其抗癌作用。

本研究旨在探讨阿霉素是否通过激活细胞氯通道而诱导凋亡性细胞 皱缩，从离子通道的角度来探讨阿霉素诱导CNE-2Z细胞凋亡的作用机制。

1材料与方法 1.1细胞培养用含10%小牛血清、双抗(1×105U·L-1青霉素与100mg·L-1 链霉素)的RPMI1640生长液，在37°C恒温培养箱(5%CO2、饱和湿度)内常规培养 低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z),每两天传代1次。实验前取对数生长期的CNE-2Z细 胞，用0.25%胰酶进行消化传代，收集、重悬细胞，将细胞悬液接种于直径22mm 的圆形玻片上，置入培养箱使细胞贴壁，待细胞贴壁1h后进行实验。

1.2主要试剂与药品盐酸阿霉素固体粉末购于上海生工生物有限公司， 用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成浓度为2.5mmol·L-1的储存液，储存在4℃冰 箱中，使用前稀释至终浓度。氯通道阻断剂 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoate(NPPB)购自Sigma公司，溶于 dimethylsulfoxide(DMSO)中，配成100mmol·L-1的储存液，工作浓度为 100μmol·L-1.等渗灌流液组成 (mmol·L-1):10HEPES,0.5MgCl2,70NaCl,140D-mannitol,2CaCl2,用冰点渗透压计 (Osmomat030,Gono2tec)调节溶液渗透压至300mOsmol·L-1,用Tris-base调节pH至7.4.1.3细胞容积测量将贴有细胞的玻片置于灌流槽内，在倒置相差显微镜 (IX71,Olympus,日本)下选择固定视野，用图像分析软件 (Image-ProPlus6.3,MediaCybernetics,USA)控制数字式摄像机 (RETIGA4000R,QImaging,Canada),进行连续拍摄，每2min拍摄一幅，直至2h.拍摄 的图片用ScionImage图像分析软件(ScionCorporation)处理，测量细胞直径与面积， 用以下公式计算细胞容积(V):V=4/3×(直径/2)3,并标准化细胞容积 (Vst):Vst=(Vt/Vo)×100%(Vt:细胞的实际容积，Vo:药物刺激前即等渗条件下(对 照)的细胞平均容积).实验分为空白对照组(Iso)、阿霉素组(ADM,2.5μmol·L-1)、 氯通道阻断剂NPPB组(100μmol·L-1)、阿霉素(2.5μmol·L-1)+NPPB(100μmol·L-1) 组。实验环境温度为室温(20℃~24℃). 1.4流式细胞术检测细胞凋亡细胞种植于6孔板中，培养箱中培养12h, 按上述实验分组进行处理。36h后，收集细胞，用PBS冲洗，并用预冷的70%乙醇 于-20℃固定30min.PBS清洗并离心，加入propidiumiodide(PI,50mg·L-1),室温避光 染色15min.用流式细胞仪(CoulterEPTCSXL-31240,Coulter,USA)进行分析。

1.5膜片钳全细胞记录技术EPC-7膜片钳放大器 (ListElectronic,Germany)用于记录全细胞电流，CED1401(Cambridge,UK)用于数字 化(采样频率3kHz)电流和电压信号。拉制的电极是硼硅酸盐毛细玻璃管，其内径 为0.86mm,外直径为1.5mm,内含细长丝，于垂直微电极拉制器(PB-7)上，分两步 拉制。将电极内液充灌至电极容积的1/3至2/3间，此时阻抗约为(5-10)MΩ。全细 胞记录模式构建完成后，开始记录实验数据。将细胞钳制在氯离子的平衡电位 (0mV).按指令电压的顺序(±40,0和±80mV)循环记录氯电流变化。每一电位持续时 间约200ms,两电位之间间隔4s.形成全细胞记录后，补偿电容。灌流等渗液3min 后，加入阿霉素，连续观察氯电流变化，待阿霉素激活氯电流达峰值，并平衡5min 后，灌流含氯通道阻断剂与阿霉素的等渗液，观察氯电流变化，直至电流抑制到 最小值，并平稳3min以上。实验数据用EPC(CED,Cambridge,UK)软件分析。实验 环境温度为室温(20℃~24℃). 全细胞膜片钳记录所需电极内液组成(mmol·L-1):1EGTA[乙二醇-双 -(2-氨基乙醚)四乙 酸],1.2MgCl2,70N-methyl-D-glucaminechloride(NMDG-Cl),10HEPES,140D-mannit ol和2ATP,并用Tris-base调节pH至7.25. 1.6统计学处理采用SPSS12.0软件对实验数据进行统计与分析，数据 用珋x±s表示，采用方差分析(ANOVA)检验差异的显着性。2结果 2.1氯通道阻断剂抑制阿霉素诱导的鼻咽癌细胞凋亡用流式细胞仪检 测阿霉素诱导的鼻咽癌细胞凋亡率。实验结果显示，不加任何药物处理的空白对 照组细胞，其凋亡率为(1.74±2.34)%(n=3)(Fig1A),而用2.5μmol·L-1的阿霉素处理 36h的细胞，凋亡率增加至(23.56±3.45)%(n=3,P0.01,vscontrol)(Fig1C). 为了探讨氯通道在阿霉素诱导的鼻咽癌细胞凋亡中的作用，我们观察 了氯通道阻断剂NPPB对阿霉素诱导的凋亡的影响。结果显示，单纯用 NPPB(100μmol·L-1)处理的细胞，凋亡率为(1.58±1.35)%,与空白对照组相比，差 异没有显着性(n=3,P0.05,vscontrol)(Fig1B).NPPB(100μmol·L-1)与阿霉素 (2.5μmol·L-1)共同处理细胞，CNE-2Z细胞凋亡率为(13.29±2.78)%,与阿霉素组凋 亡率(23.56±3.45)%相比，差异有显着性(n=3,P0.01)(Fig1D). 2.2氯通道阻断剂抑制阿霉素诱导的鼻咽癌细胞凋亡性容积减小细胞 图像分析结果显示，等渗液灌流细胞2h,细胞容积及形态基本保持不变(Fig2A).而 用含2.5μmol·L-1阿霉素的等渗液灌流细胞10min内，便可观察到CNE-2Z细胞的 凋亡性容积减小的发生，在连续观察120min的过程中，发现细胞体积逐渐减小， 皱缩(Fig2B).而阿霉素和NPPB联合作用120min时的细胞体积并没有减小 (Fig2C).Fig2D显示了药物作用前后120min细胞容积变化百分率，阿霉素灌流 120min时细胞体积减小至(90.36±0.42)%(n=21,P0.01),阿霉素和NPPB联合作用组 细胞体积为(102.83±0.44)%(n=27),与阿霉素组相比，差异有显着性(P0.01).单纯用 NPPB灌流细胞，细胞体积有所增大，120min时为(104.05±0.65)%(n=14). 实验结果表明，氯通道阻断剂NPPB可以明显抑制阿霉素诱导的鼻咽 癌细胞容积减小，提示阿霉素可能通过激活氯通道而诱导鼻咽癌细胞凋亡，早期 发生的凋亡性容积减小。2.3阿霉素激活的CNE-2Z细胞氯电流为了进一步验证阿 霉素是否通过激活细胞氯通道而诱导细胞凋亡性容积减小，我们用全细胞膜片钳 技术记录了阿霉素激活的CNE-2Z细胞氯电流。Fig3A所示为阿霉素诱导的鼻咽癌 细胞氯电流全程图。在等渗条件下，可记录到一个微弱且稳定的背景氯电流 (Fig3A、B).胞外灌流阿霉素，可以明显激活氯电流，该电流具有外向优势，外 向电流明显大于内向电流，且未见明显时间依赖性失活(Fig3A、C).该电流的翻 转电位为(-3.00±0.84)mV(n=8),接近氯离子平衡电位。当钳制电压为±80mV时，该 电流的平均峰值高达(-31.67±2.38)pA/pF(-80mV)、 (49.41±3.23)pA/pF(+80mV)(n=6,P0.01,vsIso)(Fig3E).在阿霉素激活氯电流且达平稳的基础上，加入氯通道阻断剂NPPB(100μmol·L-1),氯电流迅速降低(Fig3A、D). 其对外向电流的抑制率为(79.96±6.57)%(+80mV),对内向电流抑制率为 (76.64±4.66)%(-80mV)(n=5,P0.01,vsADM)(Fig3E),对内外向电流间的抑制作用差 异无统计学意义。以上实验结果提示，氯通道在阿霉素诱导CNE-2Z细胞凋亡早 期的过程中起重要作用。

在所有实验中，用来配制NPPB的DMSO在灌流液中的终浓度低于 1%(V/V),其对阿霉素诱导的细胞容积减小及激活的氯电流没有影响，且24h内无 细胞毒性。

3讨论 细胞凋亡异常在肿瘤以及许多疾病的发生发展中起着重要的作用。细 胞凋亡发生于生理以及病理状态下对不同刺激的应答过程中，具有一系列生化和 形态学特征，其伴随着细胞进行性的体积缩小，以及线粒体细胞色素C释放、 caspase激活、核固缩、DNA片段化和凋亡小体的形成[9]等。其中早期细胞皱缩 或凋亡性容积减小(AVD)是在等渗状态下发生的细胞体积缩小，具有普遍的意义。

研究表明[10],AVD发生于细胞色素C释放、caspase活化以及DNA断裂之前，是细 胞凋亡早期的标志性事件。

鉴于AVD在细胞凋亡早期触发机制中的关键性作用，深入探讨AVD 的发生、发展过程及其机制，对于揭示凋亡规律有重要意义。

AVD的发生被认为与细胞内K+与Cl-浓度减小有关[11].在凋亡早期， 凋亡诱导剂激活钾通道与氯通道，促使K+与Cl-外流，并驱动水的外流，致使细 胞体积减小发生AVD,进而诱发凋亡[6,12].氯通道参与细胞的多种生理功能，如细 胞增殖[13]、迁移[14]、凋亡[6]、细胞溶血[15],还可参与冰片引起的细胞体积减 小过程[16].我们前文报道，中药丹参酮发挥抗肿瘤作用的机制可能是通过激活氯 通道引起氯离子和水外流，诱导AVD发生，进而引起细胞凋亡[8].阿霉素作为一 种常用的抗肿瘤药物，它是否也可能通过激活氯通道诱导AVD和细胞凋亡目前 国内外没有相关报道。本实验采用活细胞影像系统实时拍摄细胞图像，分析细胞 凋亡早期的细胞容积变化。实验结果表明，在阿霉素作用的10min内，便可观察 到CNE-2Z细胞凋亡性容积减小的发生;而在阿霉素继续作用的2h内，细胞容积持 续减小。流式细胞术检测到阿霉素诱导CNE-2Z细胞凋亡，氯通道阻断剂NPPB可 以完全阻抑CNE-2Z细胞凋亡性容积减小、明显阻抑细胞凋亡，提示阿霉素可以 激活CNE-2Z细胞氯通道，进而诱导细胞发生AVD和细胞凋亡。为了进一步验证这个观点，我们用膜片钳法记录CNE-2Z细胞阿霉素 激活的全细胞电流，直接观察阿霉素对氯通道的激活作用。结果显示，细胞外灌 流阿霉素可激活一个外向电流，该电流与氯离子跨细胞流动所产生的电流一致， 其翻转电位接近氯离子的平衡电位-0.9mV(根据本实验所用细胞外灌流液及电极 内液配方计算而得),该电流可被氯通道阻断剂NPPB抑制，由此推知该电流为氯通 道所介导的氯电流。本实验结果为阿霉素激活氯通道提供了直接的实验证据。由 于实验用细胞内外液主要离子为Na+、Cl-、Ca2+,而在本实验条件下计算出的Na+、 Ca2+平衡电位均高于200mV,因此该电流与上述两种阳离子电流无关。

本实验观察了阿霉素对氯通道的作用，以及阻断氯通道对阿霉素诱导 凋亡和凋亡性容积减小作用的影响。结果表明，阿霉素可激活鼻咽癌细胞氯通道， 氯通道阻断剂NPPB可以明显抑制阿霉素诱导的氯电流、拮抗阿霉素引起的细胞 凋亡性容积减小和细胞凋亡，提示阿霉素可能通过激活氯通道诱导细胞凋亡，氯 通道在阿霉素抗肿瘤机制中发挥重要作用。本实验的完成，加深了我们对阿霉素 抗癌机制的认识。