血管性血友病因子范围 [血管性血友病因子体外对胃癌细胞BGC823增殖和]

血管性血友病因子体外对胃癌细胞BGC823增殖和

结果 vwf ab能够抑制 bgc  823细胞的增殖，抑制作用呈剂量及时间依赖性；
细胞形 态学观察vwf ab作用对细胞生长具有明显的细胞毒作用；
mtt黏附实验结果显示 vwf ab处理后细胞的黏附率较对照组明显下降（p＜0.05），ⅳ型胶原高浓度组较 低浓度组细胞黏附率增大（p＜0.01）。结论 vwf在体外能够影响胃癌细胞 bgc  823的增殖，并诱导细胞形态改变，促进细胞与细胞外基质的黏附。

【关键词】 vwf；
胃癌细胞；
增殖；
黏附 effect of von willebrand factor on proliferation and adhesion of human gastric cancer cell line bgc  823 in vitro wang min, zhang hong, yang ai  jun, liu wei, wang chen  yu, li min institute of pathology, school of basic medicine, lanzhou university, lanzhou 730000, china corresponding author: li min, e  mail: limin0606@163.comabstract：objective to investigate the effect on proliferation and adhesion of vwf in human gastric cancer cell line bgc  823 in vitro, and to clarify its probable mechanism. methods human gastric cancer cell line bgc  823 cultured in vitro was treated with vwf antibody (vwf ab).the effect of vwf on the proliferation and adhesion of bgc  823 in vitro was detected respectively by mtt colorimetric assay. the cell morphological changes were observed with inverted microscope. results vwf ab inhibited the proliferation of bgc  823 in a time  and concentration  dependent manner. significant cytotoxicity of vwf ab on bgc  823 cells was observed by cell morphology. compared with the control group, the adhesion ability of the bgc  823 cells was decreased significantly (p0.01) after treatment with vwf antibody. conclusion vwf has significant effect on the proliferation of bgc  823 cells and the cell morphological change in vitro, vwf takes an important part in the progress of adhesion on the bgc  823 cells. key words：vwf;
gastric cell;
proliferation;
adhesion 血管性血友病因子（von willebrand factor，vwf）是一种由血管内皮细胞 及巨核细胞合成和释放的大分子糖蛋白，生理状态下参与凝血的发生。

WwW.133229.CoM目前研究［1］表明与肿瘤的转移关系密切，但对其机制的研 究报道较少。为了探索vwf对于肿瘤发生、发展及其恶性生物学行为的影响，本研究通过体外培养胃癌细胞bgc  823，采用vwf抗体进行干预，观察vwf对肿瘤细 胞增殖和黏附能力的影响，并初步探讨其作用机制，为vwf临床运用提供实验依 据。

1 材料与方法 1.1 材料 rpmi  1640（美国gibco公司）；
胰酶（美国amresco公司）；
超级新生牛 血清（fbs）（杭州四季青生物工程有限公司）；
ⅳ型胶原，兰州大学病理研究 所自制；
四甲基偶氮唑蓝 （mtt）及牛血清白蛋白（bsa）（美国sigma公司）；

兔抗人vwf多克隆抗体（ab6994，abcam公司）；
人胃癌细胞株bgc  823购于中国 科学院上海细胞生物研究所，经预实验检测显示能够表达vwf。

1.2 细胞培养 用含10 ％灭活新生牛血清的rpmi  1640 培养液（含100ku/l青霉素, 100ku/l链霉素）在37℃、 5％ co2及饱和湿度的培养箱中维持培养。

1.3 mtt法测定vwf ab对bgc  823细胞增殖的影响 bgc  823细胞以5×105／ml的密度接种于96孔板中，同时每孔加vwf ab， 根据预实验结果使其终浓度分别为0、5、10、20μg／ml，每个浓度平行3孔，对 照组加入等体积培养液，置co2培养箱培养。分别于24、48、72h后取出96孔板， 弃上清，加200μl／孔无血清rpmi  1640及20μl／孔mtt，4h后弃上清，加200μl／ 孔二甲基亚砜（dmso）震荡10min混匀，待溶解完全后用酶标仪測a570值。细胞 增殖抑制率计算公式如下：细胞增殖抑制率（ir％）＝（1－实验组a570／对照组 a570）×100％。

1.4 细胞形态学观察 bgc  823细胞以5×104／孔的密度接种于6孔培养板内，对照组无干预，常 规培养；
处理组在培养基中加入vwf ab 20μg/ml；
每组3个复孔。24、48、72h时 分别于倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。

1. 5 黏附抗体抑制实验将vwf ab（20μg/ml）加于rpmi  1640培养基中，与bgc  823细胞共培养 48h；
将96孔板预先分别用3g／ml及1.5g／ml ⅳ型胶原20μl／孔包被，2％ bsa 封板处理，加入调好的细胞悬液200μl／孔（5×105／ml）；
co2培养箱分别孵育 30、60、90、120min后，弃去培养液，pbs冲洗除去未黏附细胞；
弃pbs后加入mtt 20μl，及无血清rpmi  1640 200μl，co2孵育3h；
吸弃培养孔内上清液，加入dmso 200μl溶解，噻唑兰显色，酶联免疫检测仪570nm测各孔吸光度（a570）值，同时 设立相应的rpmi  1640培养对照组。各组重复3次。

1.6 统计学方法 采用spss 11.5统计软件进行分析。计量资料以±s表示，组间差异比较采用 方差分析和kruskal  willis检验， p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 vwf ab对bgc  823细胞增殖的影响 mtt法检测结果显示bgc  823细胞的生长受到明显的抑制，随着作用时间 延长，抗体浓度增大，增殖抑制率增加，表明抑制作用与浓度和作用时间均呈明 显的依赖关系，见表1。表1 vwf ab对bgc  823细胞增殖的抑制率 同一时间不同 浓度比较，*：
p＜0.05；
不同时间同一浓度比较， #：p＜0.012.2 vwf ab对bgc  823 细胞形态的影响 对照组bgc  823细胞无形态学改变，呈上皮型贴壁生长，多呈纺锤形、多 边形，少数呈长梭形，细胞轮廓清晰，细胞间接触紧密，细胞生长旺盛，细胞核 异型性明显，核仁清楚，细胞质丰富。vwf ab处理48h时细胞分布较对照组稀疏， 细胞呈纤维样生长，伪足较长，细胞核及细胞质轮廓折射增强，较粗糙，部分细 胞不再贴壁生长，悬浮于培养液中；
处理72h时细胞形态失常，胞体变圆和不规 则、脱壁，细胞间接触变松，胞浆中颗粒增多，增殖变慢，细胞周围出现碎片， 部分细胞死亡后漂浮在培养液中，见图1。

2.3 vwf ab对bgc  823细胞与细胞外基质成分  ⅳ型胶原黏附能力的影响 经 vwf ab作用细胞48h后，随着时间延长（30、60、90、120min），bgc  823 细胞在ⅳ型胶原上的黏附增加（p＜0.01），差异有统计学意义；
vwf ab处理组与 对照组比较，细胞在各时间点上黏附明显下降（p＜0.05），差异有统计学意义；
ⅳ型胶原。

3 讨论 肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，涉及多种因素的相互作用。oleksowicz 等[2]首次报道伴有血道转移的恶性肿瘤患者血浆vwf水平增高；
eppert等[3] 研究 发现骨肉瘤患者发生远处转移时，转移灶中vwf含量增高；
相反terraube等[4]研究 发现在vwf基因缺陷小鼠，黑色素瘤自发性肺转移的转移潜能增加。但是在胃癌 中，尚没有相关的研究报道，我们推测vwf也参与了胃癌的发生发展。

我们的研究表明，vwf ab能有效抑制胃癌细胞bgc  823的增殖，细胞增殖 抑制率随作用时间的延长和浓度增加而增高，具有时间和剂量双依赖性，提示vwf 除了在正常生理状态下参与凝血过程的发生外，亦能够影响胃癌细胞bgc  823 的增殖，在胃癌的发生中发挥重要作用。同时通过细胞形态学观察发现，经vwf ab 处理后，细胞形态失常，推测vwf可能通过影响细胞的形态，进而改变肿瘤细胞 自身的黏附、迁移相关特性，影响肿瘤的转移。

肿瘤细胞的黏附性在其侵袭和转移中起着极为重要的作用[5]。terraube等 [4]研究表明黑色素瘤细胞能与vwf发生黏附，呈时间依赖性；
noelia 等[6]研究表 明vwf抗体能够抑制乳腺癌细胞与细胞外基质的黏附。我们的实验结果证实：用 抗vwf抗体阻抗vwf作用后，bgc  823细胞与细胞外基质的主要组成成分－ⅳ型胶 原的黏附能力降低，提示了vwf能够促进胃癌细胞bgc  823与基质成分的黏附， 推测vwf可能与肿瘤细胞直接黏附，或与肿瘤细胞表面相关黏附分子黏附，通过 其“桥梁”作用，促进肿瘤细胞与细胞外基质的黏附，进而改变侵袭、迁移相关性 质，促进肿瘤的转移，其具体作用机制还需进一步的研究。

同时，随着时间延长，细胞的黏附率增加，表明肿瘤细胞与细胞外基质的 黏附呈时间依赖性。此外，随着ⅳ型胶原浓度升高，bgc  823细胞相应的黏附能 力增高，提示ⅳ型胶原能够诱导肿瘤细胞的黏附，呈剂量依赖性，这与胡劲松等 ［7］关于ⅳ型胶原可通过诱导肿瘤细胞黏附和迁移，从而促进肿瘤细胞浸润和 转移的实验报道相一致，进一步表明肿瘤细胞的黏附能力受到多因素、多水平的 调节。

综上所述，本实验研究证实了vwf在体外能够影响胃癌细胞bgc  823的增 殖，并诱导细胞形态改变；
同时能够促进细胞与细胞外基质的黏附，在肿瘤的转 移中发挥重要作用。