康腹止泻片微生物限度检查法验证|什么是微生物限度

康腹止泻片微生物限度检查法验证

【关键词】 康腹止泻片;微生物限度检查;培养基稀释法 abstract:objective to establish a method for microbial limit test of kangfuzhixie pills.methods culture medium diluted method was used. results culture medium diluted method can eliminate the pills′ inhibiting effect on bacteria,fungi,yeast and examine designated microbial species.conclusion this method is simple,accurate,feasible and suitable for microbial limit test and quality control of kangfuzhixie pills. key words:kangfuzhixie pills;
microbial limit test;
culture medium diluted method 康腹止泻片是由木馏油、老鹳草粉、黄柏干浸膏等药材经加工而成 的中成药片剂。wWW.133229.coM本品味特异，具有化滞止泻功效。用于饮食不 节或水土不服导致的食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻、消化不良等症。处方中的 老鹳草、黄柏具有一定的抑菌作用[1，2]，若用常规法对其进行微生物限度检查， 结果将不能真实反映样品的污染情况[3]。为此，根据《 中国 药典》2010年版 的有关规定[4]，对康腹止泻片微生物限度检查方法进行验证，以确定其是否适 用于本品的微生物限度检查，从而准确有效地检出样品中污染的微生物[5]。验 证表明，采用培养基稀释法对本品进行检查，可使污染的微生物能被顺利检出， 常规法则可用于控制菌的检查。该方法简便、快捷、准确、可行，能有效控制康 腹止泻片的质量，并可为同类药品的微生物限度检查法提供 科学 的实验依据。

1 仪器与试药 1.1 菌种 金黄色葡萄球菌[cmcc(b)26003]、大肠埃希菌[cmcc(b)44102]、枯草芽 孢杆菌[cmcc(b)63501]、白色念珠菌[cmcc(f)10123]，均购自中国药品生物制品检 定所;黑曲霉(atcc16404)购自广东省微生物研究所。1.2 培养基 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁 培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基。

1.3 供试品 康腹止泻片(批号41ea1)，大幸药品株式会社。

2 方法与结果 2.1 菌液的制备[4] 2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，培养18～24 h;培养物用0.9% 无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数为50～100 cfu的菌悬液。用于控制菌验证时制 成每1 ml含菌数为100 cfu的菌悬液。

2.1.2 白色念珠菌 取新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，培养24 ～48 h;培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数为50～l00 cfu的菌悬液。

2.1.3 黑曲霉 取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养 5～7 d，加入0.9%无菌氯化钠溶液3～5 ml，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法 吸出胞子悬液至无菌试管内，用0.05%(体积分数)聚山梨醇的0.9%(体积分数)无菌 氯化钠溶液制成每l ml含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。

2.2 供试液的制备 取样品10 g，加入ph7.0氯化钠  蛋白胨缓冲液至100 ml，用匀浆仪打 碎，摇匀，制成1∶10的供试液。

2.3 验证试验 验证实验所用培养基均按《 中国 药典》2010年版附录“微生物限度 检查法”要求，进行培养基适用性检查，且均符合规定。

2.3.1 细菌、真菌及酵母菌计数(平皿法  培养基稀释法) 在确定适合 的检查方法后，验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别 计算 各试验菌每次试验的回收率。

试验组:各取1∶10供试液1、0.5、0.2 ml和试验菌液1 ml，分别注入平 皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定 其菌数。

菌液组:取试验菌液1 ml注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株 试验菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

供试品对照组:各取1∶10供试液1、0.5、0.2 ml，按试验组操作，不加 菌液，测定样品本底菌。

计算各试验菌株的回收率，结果见表1。表1 计数验证菌各菌株回收 率结果 由表1可见:黑曲霉的回收试验，当供试液为1 ml·皿-1时，3次试验的 回收率均即可达到70%以上;白色念珠菌当稀释至0.5 ml·皿-1时，3次试验的回收 率达到70%以上;而大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌3个菌株的回收 率试验，要稀释至0.2 ml·皿-1，3次验证的回收率才能均达到70%以上。因此本品 的细菌计数、真菌及酵母菌计数均可用培养基稀释法检查:细菌计数用0.2 ml·皿-1， 真菌及酵母菌计数用0.5 ml·皿-1。

2.3.2 控制菌检查法的验证 本品为含有药材粉末投料的口服制剂,控 制菌应检查大肠埃希菌和大肠菌群，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作 为试验菌。

2.3.2.1 大肠埃希菌检查法的验证 取1∶10供试液10 ml及大肠埃希菌 菌液1 ml加入100、200 ml的bl增菌培养基中，按大肠埃希菌的检查法进行检验。

2.3.2.2 大肠菌群检查法的验证 取1∶10供试液1 ml及大肠埃希菌菌 液1 ml加入不少于15、30 ml的胆盐乳糖发酵培养基中，按大肠菌群的检查法进行 检验。

由表2可知，试验组均检出大肠埃希菌，因此本制剂的大肠埃希菌和 大肠菌群均可用常规法检查。

4 讨论本品含有木馏油、阿仙粉、黄柏粉等成分，有一定的抑菌作用，验证 试验结果证明，本品对革兰阳性菌有较强的抑制作用。药典收载的除去供试品抑 菌作用的方法有培养基稀释法、薄膜过滤法、离心沉淀法等，或几法联用。由于 本品是中成药，推断其抑菌作用不会太强，因此尝试采用培养基稀释法，通过扩 大培养基的使用量，使供试品在培养基中稀释，结果各规定菌株的回收率均达到 药典要求;控制菌则用常规法即能顺利检出试验菌。培养基稀释法操作简单，不 需要特殊仪器设备，只需增加培养基量，即可很好地消除本制剂在试验条件下的 抑菌作用问题，因此本方法简便快捷、准确有效，能很好地控制康腹止泻片的质 量。表2 控制菌验证结果 【 参考 文献 】 [1] 金晴昊，崔京浩，郭健鹏.老鹳草的研究[j].时珍国医国药，2005，16(9)：
840-841. [2] 金建玲，栾永娜，华国强.含小檗碱中药的抑菌活性与小檗碱含量的 关系[j].中医药学报，2005，33(5):19-21. [3] 许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性[j].