[半胱氨酸酶在NS398诱导HepG2细胞凋亡中的作用] 半胱氨酸酶

半胱氨酸酶在NS398诱导HepG2细胞凋亡中的作用

【关键词】 环氧水合酶类;
caspase3;
bcl  2;
凋亡;hepg2 significance of caspase in ns  398 induced apoptosis of hepg2 cell line hu dong  xia department of hematology and oncology, hospital affiliated to wuhan university of science and technology, wuhan 430064, chinaabstract：objective to investigate the possible role of bcl  2 and caspase3 in ns  398 induced apoptosis of liver tumor hepg2 cell line. methods cell apoptosis is determined by flowcytometry analysis using pi staining.the expression of bcl  2 and caspase3 protein was detected by western blot. caspase3 activity was evaluated by active caspase3 apoptosis kit with flow cytometry.results selective cox  2 inhibitor ns  398 can significantly induce apoptosis of hepg2 cells line significantly. flow cytometry assay revealed the apoptotic rate of hepg2 cells treated with different concentrations of ns  398 (0,100,200,300,400μmol/l) was (10.51±1.04)%,(27.79±2.40)%,(45.72±3.32)%,(60.22±2.03)%(p0.01) respectively,while the apoptotic peak did not appear in the control group (p0.01).the expression of caspase3 protein was up  regulated while bcl  2 protein was down  regulated,and the percentage of the cells with active caspase3 was (2.67±0.22)%, (9.53±0.15)%, (21.28±0.43)%, (39.63±0.8)%, (63.40±0.69)% (p0.01). conclusion selective cox  2 inhibitor ns  398 may activate caspase3 by down  regulating the expression of bcl  2 protein,which causes apoptosis of hepg2 cells. key words：cyclooxygenase2;apoptosis;caspase3;
bcl  2;
hepg2 近年研究表明, 环氧化酶2(cox  2)在多种恶性肿瘤中表达上调,能诱导肿瘤的发生、浸润和转移[1]。www.133229.Com流行病学研究表明, 非甾体抗炎药 (nsaids)可降低消化系统恶性肿瘤的发生率和死亡率[2],有研究报道,其抗癌机制 和抑制cox  2有关。cox  2在慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌组织中的表达明显增 高[3  4]。因而,选择性阻断或抑制cox  2的活性,可能有利于肝细胞癌的预防和治 疗。本实验观察ns  398对体外培养肝癌细胞hepg2的作用,并探讨抑制剂诱导肿瘤 细胞凋亡的可能机制,为ns  398的抗癌作用提供实验依据。

1 材料和方法 1.1 材料与试剂 ns  398 纯品、培养基rpmi 1640（美国sigma公司）, 鼠 抗人bcl  2、caspase3单克隆抗体(美国santa cruz 公司), rnase、1kb dna ladder、碘 化丙啶(pi)和caspase3活性检测试剂盒（深圳晶美公司)。

1.2 细胞培养 人肝肿瘤细胞株hepg2购自上海科学院细胞中心。在含有 10%的胎牛血清、青霉素100u/ml及链霉素100u/ml的rpmi  1640培养基中37℃、 5% co2条件下培养箱中贴壁培养,每48h换液传代一次,取生长良好，细胞活性大于 98%的细胞进行实验。

1.3 细胞周期测定 将终浓度为100、200、300、400μmol/l的ns  398与肝 癌细胞作用24h后, 0.25%胰酶消化,收集制成1×105个细胞的单细胞悬液, 收集六 孔板内细胞制备单细胞悬液。磷酸盐缓冲液(pbs)洗2次,70%冰乙醇固定。检测时 以pbs洗2次,加入200μl rnasea(1g/l),37℃水浴30min,再加pi染色液避光反应30min, 上机检测,multicycle软件分析亚二倍体峰。

1.4 细胞蛋白质样品制备及蛋白定量 hepg2细胞bcl  2和caspase3蛋白质 表达:以1×106个hepg2细胞接种于100ml培养瓶,细胞贴壁后换液,加入不同浓度的 ns  398的使其终浓度分别为100、200、300、400μmol/l。设不进行药物干预的细 胞为对照组。经处理后的细胞立即弃去培养液,洗涤,离心。加预冷的细胞裂解液 (0.1mol/l nacl, 0.01mol/l tris hcl,ph 7.6, 0.001mol/l edta,100μg/ml pmsf,2μg/ml leupeptin)0.1ml,裂解30min, 然后与10 000g离心10min,取上清备用。以上所有操作 均在4℃下进行。测定蛋白,并调各组蛋白浓度一致。

1.5 western blot分析bcl  2和caspase3内参照β  actin表达水平 按文献[5] 报道的western blot方法检测,蛋白提取物经定量后，取25μg在sds  page凝胶上电 泳。转膜到醋酸纤维素膜上，丽春红染色观察转膜情况。转膜成功后，用5%的 脱脂奶粉封闭2h。加一抗cox  2抗体，内参照β  actin抗体）在4℃条件下过夜孵育；
充分用pbs漂洗3次，每次10min，再用二抗（1∶2 000稀释的辣根过氧化物 酶标记的羊抗兔、羊抗鼠igg）震荡孵育2h。洗去未结合的二抗，滴加ecl化学发 光试剂，x线片曝光显影。扫描x线片，计算机软件处理，软件进行扫描定量,每 个浓度组重复3次,取均值代表测定结果。

1.6 caspase3活性检测 采用active caspase3 apoptosis kit检测caspase3活化 情况。不同浓度ns  398(0、100、200、300、400μmol/l)处理的hepg2细胞六孔板 内培养24h后,收集细胞制备单细胞悬液, 1.5ml pbs清洗后加破膜剂a 100μl,避光孵 育15min后,以2ml pbs清洗, 1 800r/min离心5min,弃上清, 加入100μl b液 +caspase3  pe抗体或同型对照抗体,置4℃反应20min,再以2ml pbs清洗,离心弃上 清,再以1ml pbs重悬,并上机分析。用标准荧光微球校准光路和流路,以fs和ss设门, 用阴性对照确定阴性范围,依次上机检测,每个样本检测1×105细胞。

1.7 统计学方法 采用spss11.5统计软件包进行t检验分析。

2 结果 2.1 ns  398对hepg2细胞周期和凋亡率的影响 fcm显示,不同浓度ns  398作用24h后, 呈浓度依赖性改变细胞周期分布, 一方面增高g0/g1期细胞的比例,另一方面降低s期和g2/m期的细胞比例,见表1。表 1 ns  398对hepg2细胞周期的影响在dna图谱g0/g1期前出现一个代表凋亡细胞的 亚g1峰, 对亚g1峰进行定量分析表明,4种不同浓度的ns  398作用于hepg2细胞24 小时后,均显示亚g1峰,ns  398呈剂量依赖性非线性方式诱导其凋亡，见图1。

2.3 ns  398对hepg2细胞bcl  2、 caspase蛋白表达的影响 hepg2细胞经不同浓度ns  398(0、100、200、300、400μmol/l)处理24h 后,western blot显示随着ns  398处理浓度的增加，bcl  2蛋白表达下降，caspase3 蛋白表达上调，见图2。

2.4 ns  398 对hepg2细胞caspase3活性的影响 随着ns  398浓度的增高,caspase3明显活化,并且以高浓度为明显。不同浓 度(0、100、200、300、400μmmol/l)ns  398处理hepg2细胞24h后,表达活化caspase3 的细胞百分率分别为(2.67±0.22)%、(9.53±0.15)%、(21.28±0.43)%、(39.63±0.8)%、 (63.40±0.69)%。呈明显的剂量依赖性(p0.01)。3 讨论 有研究报道[6  7]cox  2的抑制剂对人类前列腺癌和胰腺癌细胞有抑制增 殖和诱导凋亡的作用。本组实验结果显示, ns  398处理后在dna图谱g0/g1期前出 现一个代表凋亡细胞的亚g1峰,对亚g1峰进行定量分析了解细胞凋亡率,结果显示 ns  398其凋亡诱导作用随药物浓度升高而增强,这表明选择性cox2抑制剂 ns  398对肝癌hepg2细胞有凋亡诱导作用。然而选择性cox  2抑制剂诱导肿瘤细 胞凋亡的分子机制目前仍不清楚。bcl  2家族是最重要的凋亡调节因子之一, 它 通过调节线粒体的功能来调节凋亡[8]。bcl  2可稳定线粒体膜并通过蛋白相关转 换孔维持膜的通透性,线粒体内膜很少有死亡启动因子,诸如细胞色素 c(cytochrome c)和半胱氨酸酶(caspase)等。caspase是一组半胱氨酸天冬氨酸蛋白 酶, 其家族成员中研究最多、功能相对较明确的为caspase3，它广泛分布于各种 类型的细胞中, 在细胞内以无活性的前体(酶原)形式存在,被激活后在细胞凋亡 中发挥关键作用,caspase3为凋亡的效应分子,是凋亡途径下游进行底物酶解的关 键蛋白酶,被称为凋亡的“执行者”。本实验发现,不同浓度的ns  398诱导hepg2 细 胞凋亡的同时发现hepg2细胞caspase3蛋白表达增加,而bcl  2 蛋白表达水平呈剂 量依赖性下降。使处理后的hepg2细胞呈程序性死亡[9  10] 研究结果证实bcl  2 在线粒体膜上形成蛋白孔道使细胞线粒体跨膜电位下降,细胞线粒体下降后释放 细胞色素c,激活caspase蛋白酶级联反应[11]。本实验结果显示ns  398处理hepg2 细胞后其caspase3酶活性升高,因此我们推测ns  398可能通过调节bcl  2蛋白的 表达激活caspas3,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。

总之,我们的实验结果表明选择性cox  2 抑制剂能够诱导肿瘤细胞凋亡, 这种效应可能与caspase3蛋白表达增加,bcl  2 蛋白表达下降,从而活化caspase3 有关。确切的机制还有待于进一步深入研究。