[阿霉素对人乳腺癌细胞MCF7表达KIF4A的抑制作用]脂质体阿霉素治疗乳腺癌

阿霉素对人乳腺癌细胞MCF7表达KIF4A的抑制作用

方法：用Western blotting方法检测阿霉素处理MCF  7细胞后不同时间该细胞表 达的KIF4A蛋白;用不同浓度的阿霉素处理MCF  7细胞96 h后,检测KIF4A蛋白， 并进行衰老相关半乳糖苷酶染色。结果：与未用阿霉素处理的MCF  7细胞相比， 阿霉素处理的MCF  7细胞表达KIF4A蛋白降低;衰老相关半乳糖苷酶染色率由 5%提高到42%，染色阳性的细胞形态亦呈衰老样变。结论：阿霉素处理MCF  7 细胞可使KIF4A蛋白表达水平降低，KIF4A蛋白表达降低与阿霉素引起MCF  7 细胞衰老的关系有待进一步研究。

【关键词】 KIF4A蛋白;
阿霉素;
细胞衰老;
MCF  7细胞 Inhibitory effect of adriamycin on expression of KIF4A in human breastcancer cells MCF  7 WANG Lu, WU Hui  juan, XU Ning, WANG Cong  yang, HE Ze, SHEN Chuan  lu(Department of Pathophysiology and Pathology, School of Basic Medical Sciences, Southeast University, Nanjing 210009, China) [Abstract] Objective: To study the effects of adriamycin on expression of KIF4A protein in MCF  7 cells. Methods: During different periods of time after the cells treated with adriamycin, the expression level of KIF4A protein was detected by Western blotting. Then, 96 h after the MCF  7 cells were treated with different concentrations of adriamycin, the expression of KIF4A protein was monitored by Western blotting, and at the same time the senescent MCF  7 cells were measured by using the method of senescence associated  β  galactosidase stain. Results: Compared with the untreated MCF  7 cells, the expression level of KIF4A protein in the MCF  7 cells treated with adriamycin was significantly decreased. The MCF  7  cells positive for the senescence associated  β  galactosidase marker were increased from 5% to 42% by 1 μmol•L-1 of adriamycin. Meantime, the positive staining MCF  7 cells exhibited a characteristic enlarged and flattened morphology. Conclusion: The expression of KIF4A protein decreases in MCF  7 cells treated with adriamycin. The relationship between the reduced expression of KIF4A and the cellular senescence remains to be further elucidated. [Key words] KIF4A protein;
adriamycin;
cellular senescence;
MCF  7 cells 细胞衰老是指细胞脱离细胞周期并不可逆地丧失增殖能力后进入的 一种相对稳定的状态，是正常细胞的必然归宿[1]。随着细胞衰老，许多基因的 表达发生变化，包括促进生长的相关因子低表达、抑制生长的相关因子过表达以 及下游途径的干预[2];同时端粒和端粒酶也发生改变[3]。肿瘤细胞往往具有衰老 障碍而表现出无限增殖，因此，深入研究肿瘤细胞衰老的分子机制将为肿瘤的有效防治提供线索。

阿霉素是一类临床常用的抗肿瘤药物，虽然人们已知阿霉素可与 DNA发生交叉联结，抑制 DNA合成，对 RNA和蛋白的合成也有一定的抑制作 用，但其治疗肿瘤的机制仍不完全清楚。

Elmore等[4]报道阿霉素能导致MCF  7 细胞衰老，但其机制尚有待研究。本研究发现阿霉素能抑制 MCF  7细胞蛋白表 达。

1 材料与方法 1.1 细胞培养及处理 用含10%灭活胎牛血清、100 U•ml-1青霉素、100 U•ml-1链霉素和2 mmol•L-1谷氨酰胺的高糖DMEM完全培养基于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培 养箱中培养MCF  7细胞，每2～3天用0.125%胰蛋白酶/0.5% EDTA混合液传代。

1.2 Western blotting 接种1.25×105的MCF  7细胞于35 mm培养皿。次日每皿用1 μmol•L-1 的阿霉素处理细胞2 h。用10%胎牛血清的DMEM于37 ℃、体积分数为0.05的CO2 培养箱中继续培养。分别于阿霉素处理后第12、24、48、72、96小时收集蛋白。

另外，分别用0、0.05、0.1、0.5、1、2 μmol•L-1浓度的阿霉素处理MCF  7细胞2 h，96 h后收集蛋白,用Bradford方法测定其蛋白浓度。进行SDS  聚丙烯酰胺凝胶 电泳和转膜，用抗KIF4A抗体(Santa Cruz公司)检测KIF4A蛋白，同时用抗 β  tubulin(Cell Signaling公司)蛋白作为内参对照。用化学发光法显示各种靶蛋白 的表达水平。用Image  Pro Plus 6.0软件对蛋白条带进行光密度分析后，将各蛋 白条带的光密度值用于下列公式计算KIF4A蛋白表达抑制率：KIF4A蛋白表达抑 制率(%)=[OD(未处理组KIF4A蛋白)/OD(β  微管蛋白)-OD(处理组KIF4A蛋 白)/OD(β  微管蛋白)]/OD(未处理组KIF4A蛋白)/OD(β  微管蛋白)×100%。

1.3 衰老相关半乳糖苷酶染色(senescence associated  β  galactosidase stain, SA  β  Gal) 衰老相关半乳糖苷酶染色方法 是一种用于检测细胞衰老的最常用方法[5],其主要步骤是：接种1.25×105的 MCF  7细胞于35 mm培养皿。次日每皿用1 μmol•L-1的阿霉素处理细胞2 h。用 10%胎牛血清的DMEM于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中继续培养。96 h 后用PBS清洗细胞，3.7%甲醇固定，PBS再清洗，加入染色液(1 mg•ml-1 X  gal， 5 mmol•L-1 K3Fe[CN]6，5 mmol•L-1 K4Fe[CN]6，150 mmol•L-1NaCl及2mmol•L-1 MgCl2，40 mmol•L-1 citric acid  Na2HPO4 pH6.0)。37 ℃避光孵育16 h， 染色结束后用PBS清洗细胞，倒置显微镜下观察衰老细胞，计算衰老染色率(染色 阳性细胞数/计数的总细胞数)。

2 结 果 2.1 阿霉素处理后MCF  7细胞表达KIF4A蛋白的动态变化 用1 μmol•L-1阿霉素处理MCF  7细胞2 h,在处理后第12、24和48小时，阿霉素虽可抑 制KIF4A蛋白表达，但其抑制作用并不十分明显，KIF4A蛋白与β  微管蛋白光 密度比值分析显示，其表达的抑制率为20%～35%;而在第72和96小时，阿霉素处 理的MCF  7细胞表达KIF4A显著降低，其表达的抑制率均高达65%以上(尤以第 96小时最明显)见图1。

2.2 不同浓度阿霉素对MCF  7细胞KIF4A蛋白表达的作用 分别用0、 0.05、0.1、0.5、1和2 μmol•L-1浓度的阿霉素处理MCF  7细胞2 h，96 h后，虽然 0.1 μmol•L-1以下浓度的阿霉素对KIF4A蛋白表达无明显影响，但0.5 μmol•L-1及 以上浓度的阿霉素均可显著降低KIF4A蛋白水平，KIF4A蛋白与β  微管蛋白光 密度比值分析显示其表达的抑制率均高达50%以上，并且呈浓度依赖性(图2)。图 2 不同浓度阿霉素对MCF  7细胞KIF4A蛋白表达的作用 2.3 阿霉素对MCF  7细胞衰老的作用 用1μmol•L-1 阿霉素处理或未处理MCF  7细胞2 h，96 h后进行衰老 相关半乳糖苷酶染色。染色阳性的细胞核周边出现蓝染区域，细胞呈衰老样变：
体积变大，扁平，胞浆颗粒增多，富含液泡。

结果显示经阿霉素处理的MCF  7 细胞的染色率显著增加，高达42%;相反，未处理的细胞仅5%。结果提示1μmol•L-1 阿霉素可显著诱导人乳腺癌细胞MCF  7衰老。见图3。

3 讨 论 本研究用阿霉素处理培养的MCF  7细胞，动态观察了处理后不同时 间该细胞KIF4A蛋白水平;用不同浓度的阿霉素处理MCF  7细胞，96 h后观察了 KIF4A蛋白表达和细胞衰老率，发现阿霉素处理的MCF  7细胞表达KIF4A蛋白 降低，呈现浓度依赖性，并且阿霉素促使MCF  7细胞衰老。

阿霉素抑制KIF4A蛋白表达与阿霉素促使MCF  7细胞衰老的关系尚 不清楚。KIF4A属于KIF4家族，是一类以氨基末端为驱动结构域的马达蛋白[6]，在细胞分裂，特别是纺锤体形成中具有重要作用[7-8]。KIF4A能结合并灭活 PARP  1蛋白，导致发育过程中神经细胞死亡[9]。在KIF4A敲除小鼠，细胞分裂 异常，导致非整倍体形成，并且DNA损伤应答途径异常，细胞对电离辐射的敏 感性增强，DNA损伤加重[10]。与本研究相似，在H2O2诱导人成纤维细胞衰老 中，KIF4A表达降低[11]。抑制KIF4A表达从而诱导DNA损伤应答途径(DDR)激 活，是否是阿霉素和(或)H2O2诱导细胞衰老的机制[12]有待深入研究。

肿瘤细胞往往具有衰老障碍而表现出无限增殖;相反，通过细胞衰老 肿瘤可以停滞在良性阶段而不转化为恶性肿瘤。近来，一些研究表明，除细胞凋 亡之外，细胞衰老也是化疗和放疗治疗肿瘤的主要方式[13]。很多时候，肿瘤对 化疗药物诱导的细胞凋亡产生耐药性;比较而言，肿瘤细胞更难以对化疗药物诱 导细胞衰老产生耐药性，因此，在耐药性肿瘤的治疗中细胞衰老常常是抑制肿瘤 生长的最主要机制。另外，与高剂量的化疗药物导致细胞凋亡不同，低剂量的化 疗药物常常诱导细胞衰老，所以通过诱导肿瘤细胞衰老以治疗肿瘤将有可能降低 药物的毒副作用。如果本研究的后续实验能证实KIF4A确实在肿瘤细胞衰老过程 中具有重要作用，这将可能为肿瘤的有效防治提供新的靶点。