不同品种枇杷果实酚类物质及其抗氧化活性解析|酚类抗氧化

不同品种枇杷果实酚类物质及其抗氧化活性解析

1 材料与方法 1.1 材料与仪器 5 种枇杷果实莆田市果树研究所提供，按成熟时间分为早熟的早钟6 号， 中熟的长红3 号和宁海白，中晚熟的白梨及晚熟的解放钟，果实于正常食用成熟 度采收，当天运至实验室，选取成熟度一致、无虫害、无明显损伤、果实饱满的 枇杷置于-70 ℃超低温冰箱冷冻保存待用;
表儿茶酸、鞣花酸、咖啡酸、阿魏酸、 绿原酸美国Sigma 公司;
新绿原酸、隐绿原酸、TPTZ( 2，4，6-反式2-吡啶基三 嗪) 、DPPH( 1，1- 二苯基-2- 三硝基苯肼) 上海源叶生物科技有限公司;
甲醇、 乙腈色谱纯，国药集团化学试剂有限公司;
其他试剂分析纯;
实验用水超纯水。

Agilent 1100 高效液相色谱仪美国Agilent 公司采用紫外检测器ZORBAXSB-C18 色谱柱( 150 mm 4.6 mm，5 722- 型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司;
KQ-100DE 型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;
KDC-40 低速离心机安徽 中科中佳科学仪器有限公司;
Ultra pure 超纯水机上海和泰仪器有限公司。

1.2 实验方法 1.2.1 枇杷果实酚类物质提取果实从冰箱取出去皮去核后，果肉迅速切成 碎末，准确称取10.000 g，加入30 mL 70%乙醇溶液，浸泡1 h，超声提取20 min( 温度30 ℃，功率200 W) ，再以5000 g 的转速离心20 min，减压抽滤得到滤液，滤 液用70% 乙醇定容至50 mL，即为枇杷果实提取液，用于测定DPPH的清除能力 和铁离子还原能力及浓缩后用于酚类物质分析。

1.2.2 总酚含量测定采用Folin-Ciocaileu 比色法测多酚含量，取1 mL 提取 液加入20 mL 水，2.5 mLFoLin-CiocaLteu 试剂，反应5 min 后加入2.5 mL 饱和 碳酸钠溶液，最后加水定容至50 mL 静置2 h，于765 nm 波长处测定其吸光度。

以没食子酸( GAE) 为标样绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中总酚含量， 结果以样品中含有的没食子酸当量( g /g FW)表示。

1.2.3 提取液枇杷果实抗氧化能力的测试 1.2.3.1 清除DPPH能力的测定参照文献加以修改，DPPH 乙醇溶液浓度为 2.13 10 - 4 mol /L，取等体积的DPPH 溶液和枇杷提取液混合，室温避光反应30 min 后于517 nm 波长处测定其吸光度( Ai) ;
等体积的DPPH 溶液和乙醇混合， 测溶液的吸光值( A0) ;
等体积的提取液和乙醇混合，测溶液的吸光值( Aj) 。记 录A0，Ai和Aj，按下列公式计算清除率IP:IP( %) =[1-( Ai-Aj) /A0] 100。

1.2.3.2 铁离子还原力测定参照文献方法测试提取液FRAP 值。取1 mL 提 取液，稀释至25 mL。取该稀释液1 mL，加入2.7 mL FRAP 工作液( 20 mmol /L 三氯化铁溶液、300 mmol /L 醋酸盐缓冲液、10 mmol /LTPTZ 溶液按1∶ 10∶ 1 配制) ，加入6 mL 水，37 ℃下反应10 min 后测定593 nm 处的吸光度。以硫酸 亚铁铵溶液为标样绘制标准曲线，以达到相同吸光度所需硫酸亚铁的量来计算样 品FRAP 值，单位为mmol /L。

1.2.4 枇杷果实提取液的HPLC 分析1.2.4.1 HPLC 检测条件色谱柱: Kromasil C18( 150 mm 4.6 mm) ;
进样量: 20 流速: 0.8 mL/min;柱温: 30 ℃;
检测 波长: 280 nm;
流动相A: 5%乙酸水溶液;
流动相B: 100% 乙腈。梯度洗脱程序: 0 ～25 min时A 从90% 降至70%，25 ～ 35 min 时A 从70%升回至90%。

1.2.4.2 酚单体的HPLC 分析分别准确称取7 种酚单体对照品，用色谱纯 的甲醇溶解，配制成0.1 mg /mL的溶液，测定其保留时间。再配制各酚单体浓度 为0.1 mg /mL 的混合对照品溶液并逐级稀释，测定峰面积，计算得到浓度与峰 面积的回归方程，溶液测试前过0.45 m 的滤膜。

1.2.4.3 样品的处理与分析取25 mL 的提取液减压蒸馏除去乙醇，再用正己烷萃取3 次，通过减压蒸馏除去正己烷后，用甲醇定容到5 mL，用于HPLC 分 析，溶液测试前过0.45 m 的滤膜，采用外标法计算含量。

1.3 综合抗氧化能力指数( APC) 的计算 参照文献计算综合抗氧化能力指数( APC)来进行提取液中酚类物质抗氧 化活性的总体比较:APC 指数= [每种方法测定值/ ( 每种方法测定最大值 测试 方法总数) ]。

1.4 数据分析 所有测定重复3 次，运用Origin 8.5 软件进行数据作图，运用SPSS 20 软 件进行数据分析: 单因素显著性分析( One-way analysis of variance，ANOVA) ， 皮尔森相关性分析( Pearsons correlation analysis) 。所得结果采用平均数据 标准 偏差表示。

2 结果与分析 2.1 不同品种枇杷果实总酚含量与抗氧化活性分析 没食子酸线性回归方程为y = 0.0078x + 0.0026，R2 = 0.9986，线性范围: 4.10～28.67 mg /L。对照回归方程可得5 个品种枇杷果实的总酚含量介于327.31 ～615.22 g /g 之间( 见表1) ，高低顺序为解放钟早钟6 号宁海白白梨长红3 号， 其中宁海白的总酚含量与冯健君的报道吻合，比徐红霞的结果低，可能是由生长 环境及成熟度不同引起。早钟6 号与解放钟果实的总酚含量接近于长红3 号与白 梨含量的2 倍，组间差异达到显著水平。由表2 可知道，5个品种枇杷果实提取 液均有抗氧化活性，其中DPPH 法显示清除能力排序为宁海白早钟6 号长红3 号 解放钟白梨，早钟6 号与解放钟、白梨的差异达到显著水平;
FRAP 法( 回归方 程为y = 0.9686x-0.0333，R2= 0.9982，线性范围: 0.2 ～ 2.0 mmol /L测定的结果 显示各品种抗氧化能力排序为宁海白早钟6 号解放钟长红3 号白梨。DPPH 法主 要评价物质的清除自由基能力，FRAP 法评价物质的还原能力，测试方法不同， 响应物不同，2种评价结果不完全一致说明反应底物可能有区别，可进一步分析 其组成。综合抗氧化能力指数APC 显示福建产的红肉系的早钟6 号、解放钟、 长红3 号总抗氧化活性高于白肉系的白梨，早钟6 号正是福建主栽的枇杷品种， 抗氧化能力较高说明其在营养保健方面有一定优势。

2.2 不同品种枇杷果实酚类物质组成分析