乳腺癌er表达【COX-2及VEGF在乳腺癌中的表达及临床意义】

COX-2及VEGF在乳腺癌中的表达及临床意义

【关键词】 乳腺肿瘤 the expression of cyclooxygenase-2 and vegf in breast cancer and its significance cao fei-lin, zhu-min, xie bo-jian, et al. (taizhou hospital of zhejiang province, linhai 317000, china) abstract: ［purpose］ to investigate the expression of cyclooxygenase-2 (cox-2), vascular endothelial growth factor (vegf) in breast cancer and its clinical significance. ［methods］ the expression of cox-2 and vegf in 96 cases of breast cancer tissues and cancer adjacent tissues were detected by reverse transcription-pcr. ［results］ expression of cox-2 mrna and vegf mrna was 87.50% and 83.33% in breast cancer tissues;
16.67% and 31.25% in cancer adjacent tissues respectively. the expression of cox-2 mrna and vegf mrna was significantly different between cancer tissue and cancers adjacent tissue. ［conclusion］ expression of cox-2 and vegf mrna in breast cancer is significantly increased. expression of cox-2 is closely correlated with expression of vegf . key words: breast neoplasms;
cyclooxygenase-2;
vegf;
reverse transcription polymerase chain reaction 环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，cox-2)是一种多功能的蛋白质，在多种恶性 肿瘤组织中，cox-2的表达增高,它与恶性肿瘤发生发展密切相关。

WWW.133229.cOm我们采用rt-pcr和免疫组化法检测了96例乳腺癌组织中cox-2 和vegf的表达，探讨cox-2、vegf在乳腺癌中的表达情况及其相关性，以及cox-2 选择性抑制剂用于乳腺癌高危人群化学预防和治疗的可能性。1 材料与方法 1.1 研究对象 收集台州医院肿瘤外科2002年12月至2003年5月因患乳腺癌行根治性手术 并经病理证实的肿瘤标本及配对的癌旁组织96例。同时留取石蜡标本，行he及免 疫组织化学染色。年龄23~58岁，平均42.5岁。组织类型：浸润性导管癌80例， 髓样癌8例，黏液腺癌4例，导管内癌4例。肿瘤分期：ⅰ~ⅱ期76例，ⅲ~ⅳ期20 例。

1.2 主要试剂 trizol (invitrogen公司)，m-mulv逆转录酶，rna酶抑制剂(mbi，ferments)，taq 酶（generay公司）cox-2、vegf、β-actin引物(上海生物工程公司合成)；
鼠抗人cox-2 蛋白及vegf抗体的单克隆抗体购自福建生物技术有限公司；
cox-2扩增产物为 488bp，上游引物: 5′-tcaagtccctgagcatctac-3′；
下游引物:5′-cattcctaccaccagcaacc-3′；

vegf引物序列：上游引物：5′-gctctacctccaccatgcca-3′；
下游引物：
5′-agctcatctctcctatgtgc-3′，β-肌动蛋白扩增产物为619bp，上游引 物:5′-cgctgcgctggtcgtcgaca-3′；
下游引物:5′-gtcacgcacgatttcccgct-3′。

1.3 实验方法 rt-pcr检测cox-2 mrna及vegf mrna表达：(1)提取 rna：取新鲜乳腺癌组织 50mg~100mg在液氮中速冻，玻璃匀浆器中彻底匀浆，按trizol试剂盒说明书裂解 抽提总rna，异丙醇沉淀，溶于depc水。紫外分光光度计测定a260/280比值均在 1.75~2.0范围之内。(2)逆转录合成cdna：各取2μg总rna，逆转录酶 m-mulv催化合 成cdna，再取cdna0.1μg作vegf和cox-2的pcr扩增。（3）检测cox-2 mrna表达：以 同一cdna为模板，在25μl反应体系内扩增cox-2和β-肌动蛋白。循环条件：95℃ 2min,94℃ 45s，53.2℃45min，72℃ 1min，循环35次。最后72℃延伸10min。取 5μl pcr产物于2%琼脂糖凝胶电泳，eb（溴化乙啶）染色，凝胶成像分析。⑷检 测vegf mrna表达：循环条件:95℃ 2min，94℃ 45s，51.5℃ 45min，72℃ 1min， 循环35次。最后72℃延伸10min。取5μl pcr产物于2%琼脂糖凝胶电泳，eb（溴化 乙啶）染色，凝胶成像分析。

免疫组化染色及结果判断：采用免疫组sp法，按说明书操作。病理组织切 片我院两位病理学专家阅片作出病理诊断。rt-pcr结果判定：pcr产物用2%琼脂糖凝胶电泳，eb（溴化乙啶）染色，并 用标准pcr marker ladder对照，电泳后凝胶成像分析。阳性结果为：在488bp（cox-2 mrna）和619bp（β-actin）和320bp（vegf mrna）处出现条带。

1.4 统计学处理 采用卡方检验和四格表确切概率法。检验标准α=0.05。

2 结 果 2.1 cox-2和vegf mrna及其蛋白表达情况 96例癌组织中有84例检测到了cox-2 mrna的表达，阳性率是87.50%；
而癌 旁组织中只有16例cox-2 mrna的表达，阳性率为16.67%。两者比较差异有显著性。

cox-2的表达位于乳腺肿瘤上皮细胞的胞浆内，54.17%的肿瘤组织见阳性染色（见 图1）。6.25%(6/96)的癌旁组织见不同程度的阳性染色，两者比较差异有显著性， 见表1。vegf mrna在乳腺癌中阳性率是83.33%(80/96)，而在癌旁组织中阳性率是 31.25%(30/96)，两者比较差异有显著性；
vegf的表达位于乳腺肿瘤上皮细胞的细 胞膜或细胞质，75.0%（72/96）乳腺癌中存在vegf阳性表达（图2），与癌旁组 织（25.0%，24/96）相比差异有显著性（表1）。

2.2 cox-2 与vegf mrna及其蛋白在乳腺癌组织中表达的相互关系 cox-2 mrna及其蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达与vegf mrna及其蛋白的 阳性表达呈正相关（p0.05），cox-2 mrna及其蛋白的阳性表达水平越高，其相应 的vegf mrna及其蛋白的阳性也越高。见表2、3。

3 讨 论 cox-2是前列腺素合成过程中重要的限速酶。cox-2表达与肿瘤细胞的增殖、 凋亡和血管形成密切相关[1]。目前一系列研究发现cox-2在人的很多癌前病变和 恶性肿瘤中高表达，如胃肠上皮化生、bareet食管、胃癌、结肠癌、食管癌、肝 癌、膀胱癌、口腔癌和非小细胞癌、前列腺癌、鼻咽癌和乳腺癌等。cox-2选择 性抑制剂能抑制大鼠乳腺肿瘤的发生。liu等在转基因小鼠模型中发现过度表达 cox-2的乳腺上皮细胞可发生癌变，表明cox-2的过度表达足以诱导乳腺肿瘤的发 生，因此，进一步探讨cox-2在人乳腺癌发生发展中的作用具有重要意义。本研 究显示，87.5％乳腺癌cox-2 mrna表达，54.2%cox-2蛋白呈阳性表达，而在癌旁组织中仅有16.67％可检出cox-2 mrna表达，6.25％cox-2蛋白呈阳性表达；
两者比 较差异有显著性，提示cox-2在乳腺癌的发生、发展中起着重要的作用。cox-2的 作用产物前列腺素可以促进肿瘤的新生血管生成，刺激肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤 细胞凋亡，促进肿瘤的浸润和转移，抑制机体的免疫反应。

血管的生成在肿瘤的发生发展中起重要作用。目前已知的刺激血管内皮细 胞增殖的因子有vegf、bfgf、pdgf等，其中血管内皮生成因子(vegf)是一种高度特 异性的有丝分裂原，能直接刺激新生血管的形成；
被公认为是最重要和最强的促 血管生成因子。同时vegf也是一种血管通透性诱导因子，可增加微静脉和小静脉 的通透性，是已知最强的血管通透剂。anthony等通过原位杂交法检测46例乳腺 癌活检标本，发现肿瘤细胞内的vegf表达与组织分化、远处转移密切相关，与乳 腺癌的mvd呈显著性相关，vegf蛋白在乳腺癌中高表达提示乳腺癌形成过程中伴 随vegf的高分泌，vegf与乳腺癌的发生及生长有关。淋巴转移的发生也有赖于原 发肿瘤新生血管的形成。我们在乳癌腺组织中也检测到vegf蛋白和vegf mrna都有 高表达，其阳性率分别为75%和83.33％，明显高于癌旁正常组织，同以往报道相 符。

郭贵龙等[2]研究发现cox-2的表达与mvd明显正相关，表明cox-2可以促进 肿瘤新生血管的形成。机制可概括如下：①诱导肿瘤细胞产生vegf；
②肿瘤组织 产生的pge2，pgf2及txa2等直接或间接促进血管生成；
③促使基质金属蛋白酶 （mmps）表达激活血管生成素；
④刺激bcl-2的表达来抑制内皮细胞凋亡，促进 血管生成；
⑤缺氧诱导cox-2促进肿瘤血管的形成。我们研究发现cox-2和vegf表 达明显相关，过度表达cox-2的乳腺癌细胞可能诱导vegf产生，从而促进肿瘤新生 血管的形成。本研究中乳腺癌组织中的cox-2表达与vegf的表达呈正相关，提示 cox-2参与血管形成，可能与诱导vegf的表达有关。因此，在乳腺癌中cox-2和vegf 共同参与乳腺癌的发生、发展及转移。

目前发现人类多种恶性肿瘤及癌前病变组织中有高表达的cox-2，且阳性 率较高，这为肿瘤的化学预防和治疗提供了新的思路和模式，学者们对nsaids用 于化学预防乳腺癌也产生了极大的兴趣。研究表明连续5年每日口服阿司匹林、 优布芬，乳腺癌的发生率下降约40%~50%。harris等[3]研究发现选择性cox-2抑制 剂celecoxib可以明显延迟大鼠dmba诱导的乳腺癌发生，并且较非选择性cox-2抑 制剂优布芬更为有效。目前，抗血管生成药物bevacizumab已被美国fda批准用作 转移性直肠癌的一线治疗药物，fairooz f等在联合使用bevacizumab治疗转移性结 直肠癌后证实反应率、生存率及平均寿命延长均较单独使用fluorouracil有统计学意义。因此，进一步探讨cox-2和vegf在人乳腺癌发生发展中的作用及其两者间具 体的作用机制具有重要意义，或许应用cox-2抑制剂或用vegf抗体将有望成为预防 与治疗乳腺癌的新方法。