核因子NFκB对帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX2表:黑质在哪

核因子NFκB对帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX2表

核因子NF  κB对帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX  2表 【摘要】 目的: 研究核因子（nf  κb）在1  甲基  4  苯基  1,2,3,6  四 氢吡啶(mptp)所致小鼠帕金森病(pd)模型中的影响和对环氧合酶  2(cox  2)的表 达调控作用以及人参皂甙rg1对其的影响，探讨导致多巴胺(da)能神经元变性失活 的可能机制. 方法: 采用mptp制备亚急性pd小鼠模型,用免疫组织化学法和免疫 蛋白印迹法观察小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(th),cox  2，前列腺素e2 （prostaglandine2，pge2）以及nf  κb的表达变化；
并观察给予人参皂甙rg1对上 述变化的影响. 结果: 与对照组小鼠相比,模型组小鼠出现典型pd症状,在mptp第5 次注射后24 h，黑质区nf  κb（34.6±5.6），cox  2（28.2±5.1）, pge2(36.1±4.2) 阳性细胞较对照组nf  κb（2.5±0.8），cox  2（1.0±0.3）, pge2(3.2±0.4)阳性细胞 显著增加(p0.01), th阳性神经元显著丢失60%(p0.01)；
经人参皂甙rg1处理后,模型 组小鼠pd症状减轻,与模型组比较,黑质区nf  κb（4.9±2.1），cox  2 （1.9±0.7）,pge2(4.6±0.3)阳性细胞明显减少(p0.01)，th阳性细胞数较对照组仅下 降32%. 结论: 核因子nf  κb在亚急性pd模型早期对黑质cox  2表达中可能起重 要调控作用；
人参皂甙rg1可能影响nf  κb及c0x  2表达而对小鼠多巴胺神经元 起一定保护作用. 【关键词】 帕金森病；
炎症；
环氧合酶  2；
前列腺素e2；
核因子nf  κb；

人参皂甙rg1 0引言 帕金森病(parkinson  s disease，pd)是一种常见的中枢神经系统变性疾病. 有研究［1］认为,炎症可能在pd发病过程中起重要作用, 环氧合酶  2(cyclooxygenase  2，cox  2)及其介导的炎症反应可能参与pd发病过程［2］. 核因子(nuclear factor  κappab, nf  κb)在炎症反应过程中发挥重要作用，近期的 研究显示nf  κb的激活与pd发病有关［3］. 但有关nf  κb是否参与pd模型中 cox  2表达调控的报道少见. 本研究采用1  甲基  4  苯基  1,2,3,6  四氢吡啶 （1  methyl  4  phenyl  1, 2, 3, 6  tetrahydropyridine,mptp）制备亚急性pd模型, 观察模型动物中脑黑质nf  κb和cox  2及其产物前列腺素e2（prostaglandine2， pge2）表达与小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，th)阳性神经元数量 关系及给予人参皂甙rg1后对上述变化的影响,探讨nf  κb在pd发病过程中的分子 机制，为探索pd有效防治措施提供线索. 1材料和方法1.1材料健康雄性c57bl/6n小鼠45只，8~12 wk龄，体质量25~30 g［北京维 通利华实验动物技术有限公司scxx(京)2002  0003］,小鼠均自由进食饮水,室温 （25±2）℃，单笼喂养，自然光照. mptp(美国sigma公司)；
兔抗人pge2 mab(美国 cayman公司)；
小鼠抗人th mab(美国chemicon公司)；
人参皂甙rg1（吉林大学基础 医学院化学教研中心）；
兔抗人cox  2 mab,兔抗人nf  κb（p50）多克隆抗体, 浓 缩型免疫组织化学超敏ultrasensitivetmsp试剂盒(福州迈新生物). 1.2方法 1.2.1动物分组和模型制备实验随机将小鼠分为3组，每组15只. 模型组(pd 组)：给予mptp 30 mg/kg,盐水溶，腹腔注射,1次/d,连续5 d. 人参皂甙rg1干预组 (rg1组)：除给予pd组相同的mptp处理外,mptp注射前3 d定时给予人参皂甙rg1 10 mg/kg,盐水溶，腹腔注射，并在mptp注射前2 h注射人参皂甙rg1. 溶剂组（对照 组）：注射与pd组和rg1组等体积的盐水. 上述动物均于mptp第5次注射后24 h处 死. 于每次注射药物后观察小鼠是否出现静止震颤、肌肉僵直、运动迟缓等pd行 为学表现, 判断pd鼠模型是否成功. 1.2.2免疫组织化学检测小鼠麻醉后,行40 g/l多聚甲醛磷酸盐缓冲液常规灌 注固定,迅速开颅取脑,40 g/l多聚甲醛固定48 h(4℃)后,石蜡包埋切片. 实验时取 脑组织切片常规脱蜡至水后,用tbst(ph7.4±0.2) 洗涤；
组织抗原行水浴法热修复；

30 ml/l过氧化氢阻断内源过氧化物酶,正常非免疫动物血清室温孵育10 min；
同一 组织相邻切片分别加入一抗即兔抗人cox  2 mab(1∶100)、兔抗人pge2 mab（1 ∶300）、兔抗人nf  κb（p50）多克隆抗体（1∶100）、小鼠抗人th mab(1∶400), 4℃过夜；
tbst洗涤后,加入生物素标记第二抗体室温孵育；
tbst洗涤,加入链霉素抗 生物素蛋白  过氧化酶室温孵育20 min,dab显色,中性树胶封固,光镜下观察照相. 1.2.3western blot小鼠麻醉后取脑,分离中脑黑质部分,置入细胞裂解液中, 低温匀浆,4℃震荡30 min后,12 000 g 4℃离心15 min,取上清,-80℃保存备用. 实验 时取标本蛋白定量后加入4倍体积样本缓冲液,95℃变性5 min. 取20 μg样品在100 g/l十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（sds  page）上电泳后,电转至硝酸纤维素膜, 以标准蛋白marker为参照，依mr大小切取条带,取相应条带分别加入cox  2一抗(1 ∶400)，pge2 一抗（1∶600），nf  κb（p50）一抗（1∶200）和th一抗(1∶1000), 4℃过夜,tbst冲洗后,分别与生物素标记的羊抗兔/小鼠igg抗血清(1∶200)室温震 荡孵育2 h,tbst洗涤后,与卵白素  辣根过氧化物酶复合物室温下孵育0.5 h, dab显 色. 将特异性蛋白条带扫描后,在同一条件下应用cmias真彩医学图像分析系统测定条带平均灰度值. 统计学处理:选定黑质所在区域,采用cmias真彩色医学图像免疫组化自动 分析系统进行阳性细胞计数. 各组每只动物的3张脑片数值相加后取平均值,实验 结果采用spss11.0统计软件进行统计学分析. 组间比较采用单因素方差分析和 snk  q检验，两变量间关系分析采用简单线性相关分析法. p0.05为差异具有统计 学意义. 2结果 2.1行为学观察pd组小鼠于第1次注药后10~ 20 min均出现不同程度的震颤、 竖毛、翘尾,mptp第5次注射后,pd组小鼠出现步态蹒跚、活动减少、动作变慢等症 状；
对照组未出现上述行为学变化；
rg1组与pd组相比较，上述行为学症状明显 减轻. 2.2免疫组化检测 2.2.1黑质区th阳性神经元数量变化对照组黑质致密部可见大量的th阳性神 经元,且排列整齐,呈条带状(图1a)；
pd组（57.2±12.1）与对照组（169.7±24.6）相 比较,th阳性神经元的数目减少约60%(图1b),rg1组（145.8±28.4）th阳性神经元的 缺失较pd组明显为轻,仅较对照组减少约32%(图1c). 2.2.2黑质区cox  2，pge2和nf  κb阳性细胞数量变化pd组与对照组相比较， 黑质区可见大量cox  2（28.2±5.1 vs 1.0±0.3），pge2(36.1±4.2 vs 3.2±0.4)和nf  κb （34.6±5.6 vs 2.5±0.8）阳性细胞（图2a，c，e）；
rg1组黑质区cox  2(1.9±0.7)；

pge2(4.6±0.3)和nf  κb(4.9±2.1)阳性细胞较pd组有显著减少（图2b，d，f）. 图像 分析结果显示，pd组，rg1组和对照组间差异均有统计学意义（p0.01）. 同时cox  2， pge2间存在正相关关系（r=0.576，p0.05）；
cox  2和nf  κb间也存在正相关关 系(r=0.588, p0.05). 2.3western blot检测在预染蛋白标准分子质量20×103，72×103，50×103和 61×103处,分别可见pge2，cox  2，nf  κb和th特异性蛋白条带. 灰度分析发现,pd 组与对照组相比，th的表达下降约为65％，而nf  κb和cox  2，pge2的表达则明 显升高(p0.01)；
rg1组与对照组相比较，th表达量下降约为36％，nf  κb，cox  2 和pge2的表达较模型组均显著降低(p0.01)；
对照组仅有少量nf  κb，cox  2和pge2 的蛋白表达（图3, 表1）. 表1各组小鼠中脑黑质th，cox  2，pge2和nf  κb蛋白表达水平 3讨论 pd是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,主要病理改变是中脑黑质da能 神经元进行性变性缺失. 我们采用mptp复制的小鼠模型具有pd典型行为学表 现；
western blot结果显示腹侧中脑th蛋白的表达下降,提示此模型存在da能神经元 大量丢失,说明本实验pd模型符合实验要求［4］. 近年来有研究表明,pd中存在炎症,是pd患者黑质da缺失重要原因［5］. 炎 症介质pge2及其合成限速酶c0x  2可作为炎症反应的重要生物学指标［6-7］. 实 验中我们检测了三者表达情况，发现pd组cox  2，pge2均大量表达，同时伴有中 脑腹侧th表达水平急剧下降，这些都提示pd组小鼠脑内存在严重的炎症反应，并 可能与da能神经元丢失有关［2］，说明cox  2可能通过介导炎症反应,而参与da 能神经元丢失过程. 因此，研究cox  2表达的调控机制，将对探讨da神经元的保 护机制起重要作用. 有研究［3］发现，nf  κb作为促炎症基因表达的枢纽之一, 可诱导cox  2表达，且nf  κb的激活与pd的病理机制有关. 为明确nf  κb是否参 与cox  2表达及与da能神经元变性丢失的关系，我们观察了上述三者在中脑黑质 区的表达情况，结果发现pd组nf  κb，cox  2表达明显升高，且两者间存在正相 关关系(r=0.5838, p0.05),th表达明显下降（p0.01）. 我们推测，在本实验条件下 mptp可能激活nf  κb,继而促进cox  2和pge2的表达,从而影响da能神经元的变化， 其结果与文献报道一致［8］. 人参皂甙rg1具有抗炎、抗氧化等作用. 有报道称rg1对mptp致黑质区da能 神经元的损伤有一定保护作用［9］. 为探讨人参皂甙rg1对da能神经元的保护途 径,我们对小鼠给予人参皂甙rg1干预，发现nf  κb阳性细胞以及蛋白水平较pd组 有明显减少，相应黑质区th阳性细胞数量和蛋白水平较pd组降低程度减轻. 可能 的原因是rg1通过减少nf  κb表达来抑制cox  2表达,减轻其介导的炎症反应,使 黑质da能神经元免于mptp诱导的损伤，最终起到保护da神经元作用［10］. 综上所述，核因子nf  κb可能是mptp所致亚急性pd模型中脑黑质cox  2表 达及其介导的炎症反应的重要上游事件；
人参皂甙rg1可对核因子nf  κb产生影 响进而对黑质da能神经元起一定的保护作用.