【抗人肝癌免疫毫微粒的制备及体外免疫学性质的】肝癌的免疫治疗

抗人肝癌免疫毫微粒的制备及体外免疫学性质的

关键词 毫微粒 单克隆抗体 人肝癌 米托蒽醌 中国图书分类号 R392.2 R730.61 Preparation and immunological characterization of mitoxantrone-loaded immuno-nanoparticles against human hepatoma LIU Xiao-Bo CAI Mei-Ying (Department of Immunology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041) Abstract Objective：To construct human hepatoma-specific immunonanoparticles and observe in vitro binding and killing of target cells by the immunonanoparticles.Methods:Hetero bifunctional cro sslinker SPDP was used to couple covalently McAb HAb18(anti-human hepatoma) wit h mitoxantrone-loaded bovine serum albumin nanoparticles(DHAQ-BSA-NP). A lot o f in vitro experiments,such as slide agglutination test,immunofluorescent assay, i mmunofluorescent blocking test,rosset formation test,rosset formation blocking t est and scanning electron microscopy etc,were used to confirm coupling of antibo dies to nanoparticles and specific binding of immunonanoparticles with target c e lls.3 H-TdR incorporation test was used to assay cytotoxicity of immunonano par ticles to target cells.Results:McAb HAb18 was coupled to D HAQ-BSA-NP. The immunonanoparticles could bind specifically to human hepatoma SMMC-7721 cells and exert selective killing effects on the target cells with do se-dependence.Conclusion:Conjugation technique via SPDP i s a good method for constructing immunonanoparticles. Human hepatoma-specific- immunonano particles have capacity of in vitro selective coating and killing human hepatoma cell line. Key words Nanoparticles Monoclonal antibody Mitoxantrone Human hepatoma将化疗药物吸附、包裹或夹嵌在白蛋白等生物可降解材料中制成毫微 粒(N anop articles，NP)，应用于肿瘤治疗是目前药剂学中研究热点[1，2]。毫微 粒具有载 药 量大、缓释药物、药物无需化学偶联而以游离形式被包封等多重优 点，此外它具有靶向给药 特性，即能将药物选择性浓集于病变部位，而不分布 或少分布在其它正常部位[1，3 ]。然而毫微粒的这种靶向给药是器官被动靶向， 无主动靶向结合癌细胞作用，因此毫微 粒释药杀伤癌细胞同时，不可避免对正 常组织造成损伤[4]。将肿瘤特异性抗体吸 附或交联到载药毫微粒上，制备抗体 导向的毫微粒即免疫毫微粒(Immunonanoparticles)，将具 有载药量大、缓释药 物、 主动靶向性抗癌作用等多种特性，是一种新型的肿瘤导向治疗制剂 [4-6]。我们 将抗人肝癌单克隆抗体HAb18与载米托蒽醌(Mitoxantrone,DHAQ)的 牛血清白 蛋白毫微粒(DHAQ-BSA-NP)共价交联，构建了人肝癌特异的免疫毫微粒 (HAb18-D HA Q-BSA-NP)。本文报道了此免疫毫微粒的制备、体外免疫学结合 特性及其选择性抗瘤作用 。

1 材料与方法 1.1 DHAQ-BSA-NP冻干品 本校药学院张志荣教授惠赠，批号 981216，4 ℃保存备用。

1.2 抗体 抗人肝癌单克隆抗体HAb18由第四军医大学病理教研室 陈志南教 授惠赠。抗人SIgA单抗4E3纯品由本室自制，本研究中用作对照抗体。

免抗小鼠IgG抗血清， FITC标记羊抗小鼠IgG抗体均为华美生物工程公司产品。

1.3 主要试剂 异型双功能交联剂SPDP为CAL Biochem公司产品， 用无水乙 醇配成浓度20 mmol/L;DTT为Serva公司产品;
3H-TdR为中科院上海原 子核研究所 产品。

1.4 细胞株 人肝癌株SMMC-7721，本室保种传代;人胃癌株 SGC-7901，本校陈曼玲教授惠赠。

1.5 单抗与毫微粒的交联 参照文献[4，7]方法加以改进。10 mg单 抗经0.05 mol/L,pH7.5的PBS透析，加入SPDP 10 μl，于室温下搅拌30 min，过G-25 柱，用PBS洗脱，首峰即为纯化Ab-PDP，取毫微粒30 mg，超声匀化，同前加入 SPDP，搅拌3 0 min,用0.05 mol/L pH4.5的醋酸缓冲 液离心洗涤以去除剩余SPDP， 将沉淀(NP-PDP)分散于醋酸缓冲液，加入DTT(终浓度25 mmol /L)，室温搅拌30 min，以还原NP-PDP，用PBS离心洗涤去除剩余DTT，得NP-PDP-SH。将A b-PDP和NP-PDP-SH混合，室温振荡20 h，用PBS离心洗涤数次，沉淀即为免疫毫微粒。

1.6 免疫毫微粒的鉴定 玻片凝集试验，免疫荧光法均参照文献[5] 方法进行。

1.7 花环形成实验及花环形成阻断实验[8] 取SMMC-7721细胞悬 液与不同浓度HAb18抗体混合 ，4℃作用30 min，用PBS离心洗涤细胞，加入 HAb18-DHAQ-BSA-NP，室温振荡30 min，计算花环形成率。

1.8 扫描电镜观察 参照文献[5]方法进行。

1.9 免疫毫微粒与细胞结合的免疫荧光染色 同1.6制 备荧光免疫 毫微粒(Fluorescent immunonano-particles)。在细胞悬液中加入等体 积荧光免疫毫 微粒，4℃孵育30 min，PBS离心洗涤，荧光显微镜观察。

图1 免疫毫微粒HAb18-DHAQ-BSA-NP的玻片凝集反应 Fig.1 Direct agglutination of immunonanoparticles (HAb18-DHAQ-BSA -NP) in the presence of rabbit anti-mouse IgG 1.10 荧光染色阻断实验 取SMMC-7721细胞悬液与不同浓度 HAb18抗体 混合，4℃作用30 min，洗涤，加入荧光免疫毫微粒 (HAb18-DHAQ-BSA-NP)，后续步骤同1.6。

1.11 免疫毫微粒的细胞毒试验 采用 3H-TdR掺入法，参照文献 [5]方法进行。洗去游离毫微粒后，继续培养细胞4 d。

2 结果 2.1 单抗与毫微粒的偶联 兔抗小鼠IgG抗血清加入后，原先分散均 匀的免 疫 毫微粒形成凝集块(图1)，而普通毫微粒仍处于均匀分散状态。FITC 标记的二抗加入后，免 疫毫微粒表面发出明亮黄绿色荧光(图2)，普通毫微粒未 见荧光。上述结果证明，单抗(HAb1 8或4E3)已偶联到毫微粒上。

2.2 免疫毫微粒与细胞的体外特异性结合 7721细胞周围结合有多 个H Ab18-DHAQ-BSA-NP(图3)，且结合的免疫毫微粒数量及花环形成与免疫毫 微粒 /细胞比率成正比(图4)， 当HAb18抗体(1.0,0.1 mg/ml)预先处理肝癌细胞后，能阻断H Ab 18-DHAQ-BSA-NP结合到肝癌细胞上，扫描电镜显示，多个 HAb18-DH AQ-BSA-NP紧密结合在肝癌细胞表面(图5)。免疫荧光染色显示，发 出明亮荧光的HAb18-D HAQ-BSA-NP包围在7721细胞周围形成花环(图6)，当 7721细胞经HAb18单抗(1.0，0.1 mg /ml) 处理后不能结合荧光免疫毫微粒 (HAb18-DHAQ-BSA-NP)，表现为荧光染色阴性。

证明HAb18-DHAQ-BSA-NP 能有效特异性地结合人肝癌细胞。

图2 免疫毫微粒(HAb18-DHAQ-BSA-NP)的免疫荧光染色 Fig.2 Fluorescence staining of HAb18-DHAQ-BSA-NP with FITC labeled s heep anti-IgG 图3 HAb18-DHAQ-BSA-NP与SMMC-7721结合的光镜照片 Fig.3 Light micrograph of the in vitro binding of HAb18-DHAQ-BSA-NP with SMMC-7721 cells 图4 花环形成率与HAb18-DHAQ-BSA-NP/7721细胞比值的关系 Fig.4 Relationship between rosset formation and ratio of HAb18-DHAQ-B SA-NP to SMMC-7721 cells 图5 HAb18-DHAQ-BSA-NP与人肝癌SMMC-7721细胞结合的扫描 电镜照片 Fig.5 Scaning electron micrograph of the in vitro binding of HAb18-D HAQ-BSA-NP with SMMC-7721 cells 图6 HAb18-DHAQ-BSA-NP与SMMC-7721细胞结合的免疫荧光染 色 Fig.6 Fluorescence labeling of SMMC-7721 cells by HAb18-DHAQ-BSA- NP 图7 免疫毫微粒对SMMC-7721细胞的体外杀伤作用 Fig.7 In vitro killing effect of HAb18-DHAQ-BSA-NP,4E3-DHAQ-BS A-NPand DHAQ-BSA-NP on SMMC-7721 cells 图8 免疫毫微粒对SGC-7901细胞的体外杀伤作用 Fig.8 In vitro killing effect of HAb18-DHAQ-BSA-NP ,4E3-DHAQ-BSA -NP and DHAQ-BSA-NP on SGC-7901 cells 2.3 免疫毫微粒的体外细胞毒作用 HAb18-DHAQ-BSA-NP对7721 细胞有 明显杀伤作用，且具有浓度依赖性，对SGC-7901细胞杀伤力很弱。

4E3-DHAQ-BSA-NP及D HAQ-BSA-NP对这2株肿瘤细胞均无明显杀伤作用(图7， 8)，上述结果表明，免疫毫微粒HAb 18-DHAQ-BSA-NP对人肝癌细胞具有特异 性杀伤作用。

3 讨论 SPDP可应用于抗体与白蛋白毫微粒交联以制备免疫毫微粒。有人用 SPDP法成功地构建了人膀 胱癌特异的白蛋白免疫毫微粒[4，5]，我们在此基础 上做了改进：原法是当抗体、 毫 微粒分别与SPDP反应生成Ab-PD或NP-PDP后， 将Ab-PDP用DTT还原以形成Ab-PDP-SH，这 需要Ab-PD透析、浓缩，与DTT反 应后，再次过G-25柱以去除剩余DTT等多个步骤;改进法 是在抗 体、毫微粒分 别与SPDP反应生成Ab-PDP或NP-PDP后，将NP-PDP用DTT还原以形成NP-PDP -SH ，仅需几次简单的离心即可完成。

本实验采用多种免疫学方法，包括花环 形成实验、扫描电镜 、免疫荧光法，充分证明HAb18-DHAQ-BSA-NP能良好地 结合靶细胞;采用免疫学阻断实验 包 括花环形成阻断实验、免疫荧光染色阻断 实验充分证明该免疫毫微粒与靶细胞结合的特异性 。此外免疫毫微粒的体外分 布实验表明(资料未列出)，HAb18单抗能改变毫微粒的分布，使 肝癌细胞能结合 较多的毫微粒，这进一步证明免疫毫微粒HAb18-DHAQ-BSA-NP能有效地主 动 靶向结合人肝癌细胞。

HAb18-DHAQ-BSA-NP选择性杀伤人肝癌株的作用机理：免疫毫微粒 与靶细胞孵育后洗涤， 游离部份被洗去，只有与靶细胞特异结合的免疫毫微粒 保留下来。由于HAb18-DHAQ-BSA- NP结合能力良好，故洗涤后仍有大量 HAb18-DHAQ-BSA-NP保持与靶细胞结合(光镜下明显 可见)，最终表现出特异 性杀伤效应。结合于靶细胞表面的免疫毫微粒杀伤靶细胞的方式未 明，有以下 可能途径：免疫毫微粒缓慢释药，药物在靶细胞周围形成局部高浓度，药物 扩 散入胞内，产生杀伤效应[6]。免疫毫微粒如同免疫脂质体经“内化”入靶细 胞内，在胞内释药产生杀伤作用[9]。

(编辑 许四平) 卫生部科学研究基金资助项目(No.98-1-225)及四川省卫生厅基金资 助 作者简介：刘晓波，男，34岁，博士生，主要从事肿瘤免疫研究;
蔡美英，女，57岁，教授，博士生导师，主要从事肝病免疫研究 刘晓波(华西医科大学免疫学教研室，成都 610041) 蔡美英(华西医科大学免疫学教研室，成都 610041)