肾癌的CT表现及其病理新分型21例分析|肾癌病理分型

肾癌的CT表现及其病理新分型21例分析

1.1.2 主要试剂 蛋白酶k购自amresco公司，琼脂糖购自bbi分装，dl2000购自takara公司。

makeⅰ购自天为时代生物有限公司，4种核糖核酸及taq dna多聚酶购自大连宝生 物工程有限公司。

1.2 方 法 1.2.1 石蜡组织中总dna的提取 加二甲苯1.5ml于装有组织切片的离心管中，轻微震荡，于37℃水浴放置 1h，12 000r/min离心5min，弃上清，重复1次。Www.133229.Com加入1.0ml无水 乙醇，混匀，室温放置10min，弃上清，重复1次。开盖的离心管置于55℃恒温器 干燥组织，直到组织完全干燥。用250μl消化液(50mmol/l tris，ph8.5，200mg/l蛋 白酶k)悬浮组织，37℃反应过夜或55℃ 3h，直到组织消化到透亮。然后煮沸10min， 灭活蛋白酶k，12 000r/min离心5min，吸上清直接做pcr或分装后放在－20℃保存。

用gapdh引物进行pcr扩增验证dna提取成功与否。

1.2.2 hpv16.18.33.58.dna 检测 利用primer5.0 设计hpv16.18.33.58的特异性的引物进行pcr扩增，引物由上 海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1。选用25μl扩增体系，内含模板dna 3μl，10×buffer 2.5μl，25mmol/l mgcl2 2.5μl， 10mm/l dntps 0.5μl，10μmol/l的上、下游引物各1.25μl，taq dna聚合酶1u，pcr专 用水13.8μl。hpv16的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 120s， 共40个循环，最后72℃延伸10min。hpv18的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s， 58℃ 60s，72℃ 120s，共40个循环，最后72℃延伸10min。hpv33的扩增条件：
94℃预变性5min，94℃ 60s，56℃ 60s，72℃ 120s，共40 个循环，最后72℃延 伸10min。hpv58的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，60℃ 60s，72℃ 120s， 共35个循环，最后72℃延伸10min。gapdh的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s， 55℃ 60s，72℃ 90s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

阳性结果的判断：取pcr 终产物5μl加1μl上样缓冲液点样于2%琼脂糖凝胶 中，80v电泳30min以maker作为参照物。在紫外灯下观测结果并照相，被溴化乙 锭染色的dna在maker的相应位置上出现的桔红色荧光带即为阳性,否则为阴性。

1.2.3 统计学处理 所有的数据输入计算机，采用spss11.5统计软件进行统计学分析，采用χ2 检验，p0.05认为有统计学意义。对多重感染患者，各基因型阳性率重复计算。

2 结 果 2.1 各高危型hpv在cin患者中的感染情况 宫颈上皮内瘤变的患者114例中，4种高危型hpv的总阳性例数为94例，在 宫颈上皮内瘤变的患者中hpv总的感染率为82.46％，见表2。4种高危型hpv的总 感染率在cin ⅰ，cin ⅱ，cin ⅲ组分别为53.85％，72.73％，96.97％。三组之间 比较χ2值为25.762，p0.001，cin ⅲ组高危型hpv的感染率明显高于cin ⅰ组 （χ2=26.885，p0.001）；
cin ⅲ组高危型hpv的感染率也明显高于cin ⅱ组，差异 有显著性（χ2=11.733，p0.01）；
cin ⅱ组高危型hpv的感染率虽然高于cin ⅰ组， 但无统计学意义。

2.2 各高危型hpv在cin中感染的分型情况 在宫颈上皮内瘤变的患者中，各型hpv的总感染率见表3。各型hpv的感染 率之间的差异有显著性（χ2=42.632，p0.001）。4种高危型hpv的感染率从高到低 依次为：hpv16，hpv58，hpv18，hpv33。3 讨 论 目前流行病学研究和生物学研究已经明确hpv感染为宫颈癌前病变和浸润 性宫颈癌发生的必要条件，特别是高危型hpv的感染强烈预示着宫颈上皮内瘤变 的存在。在本研究中，4种高危型hpv在宫颈上皮内瘤变患者中总的感染率为 80.07％，这进一步证实了hpv感染与宫颈疾病的关系。在这些患者中有20例cin 患 者是hpv阴性的，这些患者有可能感染了其他型别的hpv，也有可能同时还存在其 他因素的协同作用，即hpv感染并不是单一的致癌因素。

随着分子生物学技术的发展，目前已分离鉴定出110余种hpv dna，其中30 多种与宫颈感染和病变有关，根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种，高 危型hpv与宫颈癌前病变及其宫颈癌的关系最为密切。不同地区hpv的人群感染率 不同，所携带的型别不同，与宫颈癌相关的型别也不尽相同。很多学者对世界范 围内的ｈｐｖ感染的地区差异进行了大量的研究，世界癌症研究中心的clifford 等[4]应用meta分析对8 308例低度鳞状上皮内瘤变患者（来自55篇已发表的论文） 中的hpv感染的研究发现，最主要的是hpv16，其次依次为hpv31，hpv51，hpv53。

而duttagupta c等[5]报道，对22 个国家和地区、32 所医院的1 035 例宫颈癌患者 用pcr方法进行测定，发现排在前4位的依次为hpv16，hpv18，hpv45，hpv31。近 年来亚洲的学者在这方面也做了很多的工作，lee 等[6]对南韩地区的患者利用 hd-c进行hpv分型的结果为：hpv16最常见，其余依次为hpv58，hpv18，hpv52。

日本学者的研究也表明hpv16和hpv58为最常见的两种类型。而sowjanya等[7]对印 度宫颈癌患者高危型hpv的分型发现，最常见的类型从高到低依次为：
hpv16(66.7%)，hpv18(19.4%)，hpv33(5.6%)，hpv35(5.6%)。

我国在这方面研究也很多，hpv58在中国东南地区的检出率较高。江西省 的主要型别为hpv16，58，33，31。同样香港地区的主要型别也为hpv16，58。高 艳娥等[8]应用荧光偏振对上海地区确定了感染型别的研究中，前4位的依次为：
hpv16，hpv18，hpv58，hpv31。lin等[9]在中国台湾南部地区的hpv感染的患者中 的主要型别为：hpv16，hpv52，hpv58。我们对青岛地区主要高危型hpv感染进行 了研究，结果表明青岛地区高危型hpv在宫颈上皮内瘤变患者中感染的主要型别 依次为hpv16，hpv58，hpv18，hpv33。青岛地区的主要感染型别与欧洲及世界范 围内的报道有很大的不同。本研究的结果表明，在青岛地区存在着世界范围内比 较常见的hpv16 和 hpv18型，同时hpv58的感染率也很高，超过了hpv18，这与中 国东南地区的研究比较符合，同时和亚洲的韩国和日本的报道也比较一致，这与 世界范围内的研究和欧洲美洲等西方国家的研究不同。同时在该地区也存在着在中国报道较少的hpv33的感染，进一步证实了hpv感染的地区差异。这将为该地区 宫颈疾病的筛查提供了理论依据。但本研究仅对比较常见的4种类型的hpv进行了 研究，有可能还存在其他类型的感染，我们将在这方面做进一步的研究。

有研究[10]表明若重复感染同一型别的高危型hpv的妇女进展为宫颈高度 病变的相对危险度(or)高达813.0，重复感染某一高危型hpv将使其癌变的机会增 加，这提示我们不仅要检测出hpv dna的存在，还要对其进行分型。美国的mao 等[11]的一项最新的研究表明，预防性hpv16 l1 vlp疫苗能够提供对于hpv16的持 续感染及与之相关的cin ⅱ~ⅲ病变至少3.5年的免疫力。对高危型hpv进行分型， 能使我们清楚地了解本地区的高危型hpv的主要感染型别，从根本上预防宫颈疾 病的发生即型特异宫颈疫苗的研制提供理论帮助，即我们不仅要研究hpv16~18 的疫苗，更要提高对感染率较高的hpv58的注意。

有研究[12]表明，hpv16、18、52 dna的高负荷是从cin ⅱ~ⅲ到宫颈癌转 化过程中的先决条件，hpv dna的感染状态和病毒负荷是不同型别的hpv癌变过程 中的重要因素。因此，对宫颈疾病中的高危型hpv进行分型，检测其感染状态和 病毒负荷，对预测宫颈疾病的癌变具有重要的意义。