[讨论HPLC法测定黄连中生物碱的含量]黄连总生物碱含量测定

讨论HPLC法测定黄连中生物碱的含量

由于黄连的种类与炮制方法都非常多，地理分布也比较广泛，因此作为药 材它们的质量不易控制。黄连的主要药用成份生物碱的含量的准确测定对评价不 同产地黄连与质量监控具有重要意义。黄连生物碱含量测定的方法主要有高效液 相色谱法(HPLC)、薄层扫描法(TLCS)与紫外分光光度法(UV)等，它也是一味具 有广泛药效作用的中药，在国内外很多种疾病的治疗都用到了它，且黄连新的药 效又不断被发现。尤其是其是在抗癌、降血糖和改善心脑血管功能等方面均具有 较好的药效，越来越受到人们的重视，因此，对黄连进行深入研究，对黄连中的 各种生物碱进行全面的分析，以开发生药资源，扩大其药效作用，将有很大的社 会效益和广泛的开发前景。

1 实验部分 1.1 仪器与试剂 日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪、KQ-250DE型数控超声波清洗器、HH 数显恒温水浴锅、上海博讯电热鼓风干燥箱GZX-9070MBE、BL电子分析天平 FA2204N、容量瓶(10ml、25ml)、烧杯、玻璃棒、移液管、漏斗、微孔滤膜(0.45m)、 移液枪;盐酸小檗碱化学对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号：110713-200208) 纯度为98%，黄连(味连、过120网目筛)、乙腈均为色谱纯，十二烷基硫酸钠、甲 醇、磷酸二氢钾、磷酸、盐酸均为分析纯、水为蒸馏水。

1.2 对照品溶液的制备对照品盐酸小檗碱在105℃下的烘箱中干燥至恒重，精密称取对照品约 15.0mg，用甲醇溶解并定容到25.00ml，得对照品溶液的浓度为0.06mgml-1。

1.3 供试品溶液的制备 精密称取黄连粉末样品(过120目筛，80℃干燥)约50mg，加盐酸-甲醇(1：
100)溶液45ml，60℃水浴锅中温浸15min，超声处理(功率250W，频率40KHz)30min， 放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，用普通滤纸滤过，取滤液，用0.45m 滤膜再次过滤，再定容与25ml容量瓶，即得供试品溶液。

1.4 液相色谱分析条件 液相色谱分析条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂;以乙腈、 0.05molL-1磷酸二氢钾溶液(V：V=50：50;每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再 以磷酸调节pH值为4.0)为流动相;检测波长为345nm;流速：1.0mlmin-1;柱温：30℃;
进样量：20L。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5 000。在此色谱分析条件 下，待色谱基线走平后，分别精密吸取对照品溶液与样品溶液各20L，注入液相 色谱仪，测定。

1.5 阴性对照试验 按照供试品溶液的制备方法制备不含黄连提取液的空白对照溶液，在上述 相同的色谱分析条件下，分别准确吸取对照品溶液、空白对照溶液、供试品溶液 各20L，分别注入液相色谱仪。

1.6 提取工艺的研究实验 1.6.1 温浸时间的影响。

精密称取13份黄连粉末样品(过120目筛，80℃干燥)均约50mg，分别加入 盐酸甲醇(1：100)溶液45ml，浸泡5min后，分别放入60℃水浴锅中温浸提取，温 浸时间分别从0、5、10、15⋯⋯60min，然后各样品溶液进行超声处理(功率 250W)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，普通滤纸滤过，取 滤液，再用0.45m滤膜过滤，再用25.00ml容量瓶定容到25.00ml，即得提取样品。

测量各样品生物碱的含量，确定最佳提取时间。

1.6.2 温浸温度的影响。精密称取5份黄连样品粉末(过120目筛，80℃干燥)重约50mg，分别加入盐 酸甲醇(1：100)溶液45ml，分别在25℃、40℃、60℃、80℃、100℃水浴锅中温 浸提取15min，然后各样品溶液进行超声处理(功率250W，频率40KHz)30min，放 冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀并用普通滤纸滤过，取续滤液， 再用0.45m滤膜过滤，再定容于25.00ml容量瓶，即得提取样品。测量各样品生物 碱的含量，确定最佳提取温浸温度。

2 结果与分析 2.1 色谱分析条件 在本实验选择的色谱条件下分别检测对照样品溶液与样品溶液，测得色谱 图。样品色谱图、对照品色谱图来看，结果表明该色谱条件适合黄连样品分析检 测。

2.2 阴性对照实验结果 将空白溶液、供试品溶液、对照品溶液用进样器各抽取20l，分别注入液 相色谱仪。色谱分析实验。可以看出：空白溶液对应的曲线a，在色谱图中没有 出现明显的色谱峰;黄连样品曲线b中最大峰与曲线c的最大峰保留时间一致，表 明，黄连样品中采用该提取方法能提取到小檗碱，且小檗碱在提取物中含量较高， 且从峰形来看，其它成分对小檗碱的定量测定无干扰。

2.3 温浸时间分析结果 黄连提取液中盐酸小檗碱的含量与水浴温浸提取时间的检测结果。随着水 浴温浸提取时间的增加提取液中小檗碱的含量也快速增加，当温浸提取时间到 15min时小檗碱的含量也达到最高值，温浸提取时间继续增加，提取液中小檗的 含量趋平且略有下降。因此，提取黄连中生物碱的最佳温浸提取时间确定为15min。

2.4 最佳提取温度 不同提取水浴温度下提取液中小檗碱的含量检测结果如图4所示。结果表 明：随着水浴温度升高，提取液中小檗碱的含量也快速升高，当水浴温度升高到 60℃时，小檗碱的含量达到最高，继续升高水浴温度后，小檗碱的含量含量反而 逐渐降低，因此，提取黄连中生物碱的最佳温浸提取温度确定为60℃。2.5 标准 曲线的绘制将配制好的浓度为0.06mgml-1盐酸小檗碱标准对照品溶液分别进样5l，8l，10l，15l，18l，20l，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(A)，绘制 标准曲线，检测结果与标准曲线。标准曲线的回归方程为y=179842x-298324， R2=0.9911。由此可见在该检测方法下，小檗碱含量在0.3～1.2g范围内与峰面积 积分值呈良好的线性关系。

2.5 标准曲线的绘制 将配制好的浓度为0.06mgml-1盐酸小檗碱标准对照品溶液分别进样5l，8l， 10l，15l，18l，20l，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(A)，绘制标准曲线， 检测结果与标准曲线。标准曲线的回归方程为y=179842x-298324，R2=0.9911。

由此可见在该检测方法下，小檗碱含量在0.3～1.2g范围内与峰面积积分值呈良好 的线性关系。

2.6 加样回收试验结果 精密称取已测含量的黄连粉末供试品9份各50mg，按1.3供试品溶液制备方 法提取液，并定容到25ml后，摇匀，各精密量取5ml，其中1、2、3号各精密加入 用甲醇配置的盐酸小檗碱对照品溶液(盐酸小檗碱浓度0.06mgml-1)1ml，4、5、6 号各加入上述对照品溶液2ml，7、8、9号各精密加入上述溶液3ml，按供试品含 量测定方法操作，测定每份供试品含量，得到加样回收率结果。回收率在98%～ 101%之间，且RSD为1.2%，结果表明检测方法回收率好，方法准确可行。

2.8 7样品含量测定