小鼠血脂正常范围_讨论拐枣多糖对糖尿病小鼠血糖血脂的影响

讨论拐枣多糖对糖尿病小鼠血糖血脂的影响

拐枣(Hovenia acerba Lindl.) 俗称万寿果属鼠李科枳椇属落叶乔木，因其果 梗肉质膨大扭曲，肉质肥厚形似鸡爪，味甘甜如枣，故名拐枣。营养丰富，清凉 利尿，解酒醉不醒，可治风湿，有清热利尿、止渴降火和解毒之功效，果梗性甘 平有健胃补血的作用，主治头风、润五脏、利大小便，在甘肃省陇南市徽成盆地 广为栽培，产量很高。拐枣多糖(Hovenia acerbaLindl. Polysaccharides，HAP)系其 主要有效成分，可治腋下狐臭和痔疮，同其它药用植物多糖一样复杂的生物活性 与功能，而拐枣多糖在降血糖、血脂方面的研究较少。为此，本文采用ALX 诱 导建立糖尿病小鼠模型来研究拐枣多糖作用于化学性糖尿病小鼠模型，观察拐枣 多糖对糖尿病小鼠的降血糖和降血脂作用效果，来开发无毒无副作用的降糖替代 药物，对拐枣多糖综合开发提供实验技术，促进拐枣产业经济的发展具有重大意 义。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器 1.1.1 实验材料与动物拐枣采自甘肃省陇南市成县支旗镇梁旗村;实验动物和饲料均购自兰州大 学医学院实验动物中心饲料。

1.1.2 实验药品 四氧嘧啶，Sigma 公司;盐酸二甲双胍片，上海医药(集团)有限公司信谊制 药总厂生产;格列苯脲片，上海信谊药厂有限公司生产;血糖试纸，爱奥乐医疗器 械(深圳)有限公司;普鲁卡因肾上腺素注射液，远大医药(中国)有限公司生产。

1.1.3 主要仪器RE52AA 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;HH-6数显恒温水浴锅，上海千载科技 有限公司;TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂;UV759 紫外-可见分 光光度计，上海精密科学仪器有限公司;TDL-5000B 型低速冷冻大容量离心机， 上海安亭科学仪器厂;LGJ-18 型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂;全自动生化分 析仪AU5800，贝克曼库尔特有限公司;全自动血糖检测仪，爱奥乐医疗器械(深圳) 有限公司;LC-6A 高压液相色谱仪(配有 RI-10A 示差折光检测器、7725i 手动进 样器、CTO-10AS 柱温箱、CBM-20A 在线控制器和LC-solution 分析软件)，日 本岛津公司;TSK-Gel SW3000 和TSK-Gel SW4000 色谱柱，日本 Tosoh 公司等。

1.2 实验方法 1.2.1 拐枣多糖的提取 将拐枣在 50 ℃ 烘干后将其粉碎，用无水乙醇回流脱脂，50 ℃烘干，取 100 g 然后加入一定量的1000ml 蒸馏水，在40 ℃温度下溶解2 h 后，真空抽滤 所得上清液经过减压浓缩得浓缩液，与 Sevag 试剂(氯仿:正丁醇体积比4:1)按体 积比5:1 混合，振荡，离心弃去变性蛋白，重复4 次。合并水层，用 95% 的乙 醇沉淀(体积比3:1)，5000 r/min 离心10 min，沉淀物溶于40 ℃热水中，搅拌状 态下慢慢加入斐林试剂，析出铜络合物，静置1 h，倾出上清液，用水洗涤3 次， 离心分离得络合物，向络合物中加4 ℃蒸馏水，再滴加 0.5 mol/L HCl 使之全部 溶解，用 95% 的乙醇沉淀(体积比3:1)，离心，所得絮状物分别用乙醇、丙酮、 乙醚洗涤，冷冻干燥得洁白拐枣多糖粉末。

1.2.2 拐枣多糖对正常小鼠血糖水平的影响 取 KM 小鼠50 只，随机分为5 组。按250 mg/kgbw 剂量每天灌胃一次二甲双胍为药物对照组;按照100 mg/kgbw、200 mg/kgbw、400 mg/kgbw 标准每 天灌胃一次拐枣多糖，建立拐枣多糖低、中、高剂量组。在实验期间，小鼠自由 饮食和饮水，以喂食与格列本脲对照组相同体积的生理盐水为空白组，给药后1 h 眼眶静脉丛采血，用血糖仪测定FBG和称量体重。

1.2.3 拐枣多糖对正常小鼠糖耐量的影响 取 KM 小鼠60 只，随机分为6 组，设二甲双胍对照组，拐枣多糖低、中、 高剂量组，以喂食与格列本脲对照组相同体积的生理盐水为空白组，各组灌胃给 药方法依照1.2.2，每天按10%葡萄糖20 mL/10 kgbw 灌胃一次为葡萄糖对照组， 末次给药前禁食12 h，给药后30 min 眼眶采血测定0 h、0.5 h、1 h、2 h 各组小 鼠的FBG。

1.2.4 拐枣多糖对肾上腺素引起高血糖小鼠血 糖水平的影响取 KM 小鼠60 只，随机分成6 组，分组及给药方法同1.2.2， 每天按0.2 mg/kg bw 的标准腹腔注射一次肾上腺素，为肾上腺素为对照组。末次 给药前禁食__ 12 h，给药30 min 后眼眶采血测定FBG。

1.2.5 糖尿病小鼠模型建立 取 KM 小鼠适应性喂养7 d，在禁食不禁水12 h，称重后，测量FBG。随 机取10 只小鼠作为正常对照组，将其余60 只小鼠腹腔一次性注射240 mg/kg bw 新鲜配制的3% ALX 溶液，72 h 后眼眶静脉丛采血，用血糖仪测定FBG，将 FBG11.0 mmol/L 者视为造模成功。正常对照组每天灌胃一次与造模成功后的小 鼠糖尿病模型组等体积的生理盐水;按250 mg/kg bw剂量每天灌胃一次二甲双胍 为药物对照组;按照100mg/kg bw、200 mg/kg bw、400 mg/kg bw 标准每天灌胃一 次拐枣多糖，建立拐枣多糖低、中、高剂量组。在实验期间，小鼠自由饮食和饮 水，连续观察28 d，每隔7 d，测定FBG 和称量体重，测定FBG 前12 h禁食不禁 水。1.2.6 小鼠口服(灌胃)急性毒性预试验选取 50 只KM 小鼠，随机分成5 组， 一组小鼠为空白对照组。试验组小鼠进行灌服，灌服剂量分别为10000、20000、 40000、60000 mg/kg bw，给药后笼边观察。先观察30 min，在给药后的4 h 再观 察1次，以后每天早晚各观察1 次，连续观察7 d。观察的主要内容有被毛组织光 滑度、眼角膜是否有血丝、红肿现象、小鼠活动是否有异常行为，以及对小鼠进 行剖检观察各组织器官的变化。1.3 检测指标 按照1.2.2方法给药处理后，各组小鼠禁食不禁水12 h，采用血糖仪和血糖 试纸，剪尾取血测各组小鼠FBG;测定FBG后，迅速处死动物并解剖在静脉血管 采血，离心收集血清，采用全自动生化分析仪测TC、TG、HDL和LDL水平，取 主动脉顶端1 cm，10% 甲醛溶液分别固定24 h，常规石蜡切片，苏木精-伊红染 色，观察组织形态学改变。

1.4 统计分析 实验数据均以xs 表示，数据分析采用SPSS17.0软件进行t 检验统计处理， p0.05 为差异显著，p0.01 为差异极显著。

2 结果与分析 2.1 拐枣多糖对正常小鼠血糖水平的影响 格列本脲是降低血糖的特效药物之一，由于其能刺激胰腺分泌胰岛素而降 低血糖，还通过增加门静脉胰岛素水平或对肝脏直接作用，抑制肝糖原分解和糖 原异生作用，也可增加胰外组织对胰岛素的敏感性和糖的利用，而缓解人体高糖 环境，所以医疗使用范围较广。格列本脲灌胃小鼠后血糖降低明显，而拐枣多糖 低、中、高剂量组在灌胃处理小鼠后血糖均发生了降低。连续灌胃7 d 后三种剂 量组与空白组比较降血糖作用不存在显著性的差异(p0.05)，高剂量的多糖作用下 血糖浓度为5.09 mmol/L，空白对照此时血糖为5.19 mmol/L;三种多糖剂量组与格 列苯脲组相比不及格列苯脲对正常小鼠血糖的影响，血糖浓度为3.39 mmol/L。

研究结果表明，连续7 d 灌胃给予多糖，对正常小鼠的空腹血糖无显著影响，可 能无刺激正常胰岛素分泌的作用。

2.2 拐枣多糖对正常小鼠葡萄糖耐量的影响 对各组小鼠灌胃给予葡萄糖后血糖开始升高，葡萄糖组在1 h后达到最高 峰，拐枣多糖低、中剂量组对葡萄糖致高血糖有明显的抑制作用，使血糖值高峰 提前到0.5 h，血糖分别为10.73和11.26 mmol/L，而1 h后，二甲双胍组的血糖为 5.79 mmol/L，高剂量的多糖灌胃后小鼠血糖为5.83 mmol/L，两者在小鼠血糖降 低作用上表现的非常显著(p0.01)，这说明拐枣多糖对正常小鼠口服葡萄糖耐量有 明显的改善作用，但不及二甲双胍组。当正常小鼠灌胃一定量外源性葡萄糖时， 血糖迅速升高，但预先给不同剂量多糖的小鼠可以显著抑制血糖升高，增强对外源性葡萄糖的耐受量，改善小鼠糖耐量有可能是通过降低机体吸收葡萄糖的速率 或数量，从而调节血糖，这说明对于预防糖尿病和大血管病变具有重要意义。

2.3 拐枣多糖对肾上腺素引起高血糖小鼠血糖的影响 ALX 是一种常用的诱导小鼠产生Ⅱ型糖尿病的物质，其致病原因在于它 能破坏小鼠的胰岛 细胞导致氧化应激而升高血糖，通过对小鼠进行腹腔注射3% ALX，对小鼠胰岛 细胞进行特殊的破坏，从而减少胰岛素的来源使小鼠血糖升 高，小鼠进食量、饮水量、尿量显著增加，体形明显消瘦，行动迟缓，且血糖11.0 mmol/L，说明 ALX 诱导糖尿病模型成功，对糖尿病小鼠血糖的结果见表 4。

小鼠通过连续灌胃拐枣多糖治疗 28 d 后空腹血糖均明显升高，低剂量组小鼠血 糖为25.39 mmol/L，空白对照组小鼠血糖为6.40 mmol/L，两者之间存在极显著差 异(p0.01)，而ALX 模型小鼠血糖为29.10 mmol/L，与低剂量组之间相比无显著 差异(p0.05)，与中、高剂量组之间相比成显著差异(p灌胃给药二甲双胍28 d 后小 鼠的血糖为16.47 mmol/L，拐枣多糖中剂量治疗小鼠的血糖值与模型组相比有显 著性差异(p0.05)，而高剂量组血糖为16.74 mmol/L，与模型组比较血糖明显降低， 有极显著性差异(p0.01)。以上结果表明，拐枣多糖对糖尿病模型小鼠具有明显的 降血糖作用，且高剂量组降血糖效果最好，与二甲双胍组无显著差异(p0.05)。

Gong 等研究表明，马齿苋粗多糖可显著降低DM小鼠的空腹血糖浓度和提高血 浆胰岛素水平;Li 等报道黄芪多糖可显著降低血糖水平，提高血浆胰岛素浓度， 降低 细胞凋亡率，也可改善胰岛素与靶细胞特异性结合，增强对胰岛素敏感性， 有效保护和修复胰岛细胞，还可通过调节糖代谢酶活性来降低血糖水平。

2.5 拐枣多糖对糖尿病小鼠糖化血红蛋白的影响 糖化血红蛋白是人体血液中HbAlc与葡萄糖通过非酶促的缓慢结合所形 成的一种血红蛋白组分，与血糖浓度成正比，所以检测血中 HbAlc水平可以直 观的反映出血糖水平，能更好地反映机体糖代谢的情况。小鼠口服拐枣多糖后结 果见表5。在0 d时小鼠血糖高、中剂量组与模型组和对照组相比均成极显著差异 (p0.01)，低剂量组与模型组和对照组相比均成极显著差异(p小鼠口服高、中剂量 拐枣多糖7 d 后血液中 HbAlc 含量显著下降到10.95%和11.47%，与模型组的 12.51%比较具有显著性差异(p0.05)，低剂量组小鼠的HbAlc含量与模型组比较无 显著性差异(p0.05)，而口服二甲双胍的小鼠 HbAlc 含量明显降低到10.24%，其 高剂量效果与二甲双胍组无显著差异(p0.05)。这说明拐枣多糖能刺激ALX致糖尿 病小鼠现代食品科技Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.111剖 学观察正常组主动脉内膜光滑、有光泽，染色均匀，内膜下细胞排列整齐，中层平滑肌和弹力层完整。ALX 诱导糖尿病模型组小鼠主动脉内膜可见大量的内皮 细胞增生、脂质沉积，中膜平滑肌细胞增生、排列紊乱，有些部位钙化明显。二 甲双胍组和拐枣多糖高剂量组相比模型组内膜较完整平坦，内皮黏附及浸润于内 膜的单核细胞明显少于模型组，内膜增厚明显轻于模型组，说明拐枣多糖可以调 节降低糖尿病小鼠血脂，对糖尿病小鼠的血管并发症有一定的改善作用。的胰岛 细胞的再生并释放胰岛素，使胰岛素分泌增多，降低糖尿病小鼠HbAlc水平，有 效调节和改善糖代谢水平，也可能调节糖代谢酶的活性，降低小鼠血清葡萄糖水 平，降低肝磷酸化酶和葡萄糖-6-磷酸脂酶的活性，显著提高血清丙酮水平及肝 糖原含量，增加葡萄糖的利用，所以通过用拐枣多糖来降低 HbAlc水平，能有 效降低心血管病发病率，对控制和防治糖尿病具有重要意义。糖尿病小鼠在拐枣 多糖高、中、低剂量的干预下，血脂代谢发生了变化，变化结果见表6。正常组 小鼠TC、TG 和HDL 分别为1.20、0.66 和0.44 mmol/L，糖尿病模型小鼠在连续 灌胃多糖治疗7 d 后TC、TG和HDL 分别为1.60、1.20 和0.63 mmol/L，均显著 升高(p0.05)，而HDL 由0.50 mmol/L 显著降低到0.35mmol/L(p0.05)。模型组与二 甲双胍组比较，TC、TG 和HDL 均有明显升高(p0.05)，分别为1.38、1.07 和0.49 mmol/L。给药四周后，高剂量组与糖尿病模型组比较小鼠的TC、TG 和HDL， 分别为1.32、0.80和0.40 mmol/L 两者有极显著性差异(p0.01)，其对糖尿病模型 小鼠血脂的调节作用与二甲双胍组相当，两组的TC、TG 及HDL 含量均无显著 性差异(p高剂量多糖口服治疗后各小鼠LDL 逐渐恢复到0.46 mmol/L，与正常和 模型组比较均具有显著性差异(p0.05)。对各组小鼠主动脉病理变化进行解。

2.6 拐枣多糖对糖尿病模型小鼠体重的影响 在ALX诱导糖尿病模型组小鼠成功后3~4 d 内出现饮水、进食及尿量明显 增加，体质量略有下降，活动减少等表现，灌胃拐枣多糖后糖尿病小鼠体重变化 结果。正常组小鼠随时推移体重由19.02 g 逐渐增加到25.40 g，而造模成功后的 各组小鼠体形则明显消瘦，体重逐渐减少到16.05 g ，与模型组相比，在给药第 28 d后，拐枣多糖治疗组小鼠体重逐渐恢复增加，高剂量多糖治疗后小鼠体重由 18.30 g增加到18.40 g，小鼠活动与精神状况逐渐好转，多糖高剂量与二甲双胍之 间的治疗效果相似。这可能是ALX诱导后糖尿病小鼠受到胰岛素缺乏的原因，小 鼠不能充分利用葡萄糖产生的能量，破坏了糖代谢的正常过程，而不能提供生理 需要的能量，引起致脂肪和蛋白质分解加速，消耗过量，体重逐渐下降。而通过 拐枣多糖的治疗，小鼠体重逐渐恢复。

2.7 拐枣多糖对小鼠急性毒理试验小鼠口服(灌胃)急性毒性预试验中，一次性灌服拐枣多糖剂量分别为 10000、20000、40000、60000mg/kgbw，给药后笼边观察7 d，小鼠给药后各组外 观毛色光亮，无兴奋、不安、窜动、跳跃、竖毛、流泪、流涎、凸眼、扭体反应 现象，给药后摄食、进水、大小便等均无明显异常。观察期间未出现死亡和异常 反应，小鼠活动自如，LD50 未能测出。并对小鼠进行颈椎脱臼处死进行心、肝、 肺、脾、肾、子宫、睾丸、卵巢、肠等重要脏器病理检查，均未出现出血、充血、 水肿、渗出、溃疡、穿孔、胸腔、腹腔、心包膜无积液等明显病理变化。根据毒 理学评价标准，LD5010000 mg/kgbw(灌胃)属于无毒性物质，本研究中一次性灌 服拐枣多糖最大剂量为60000 mg/kg bw，远远大于毒理学评价标准，结果说明拐 枣多糖对小鼠安全无毒。

3 结论 本文研究拐枣多糖对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠血糖和血脂的影响。以腹腔 注射ALX建立小鼠糖尿病模型，连续灌胃给药28 d，研究HAP对糖尿病小鼠空腹 血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbAlc)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋 白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等指标的影响。研究表明，糖尿病模型组小鼠体 重减少，而饮食量、饮水量及排尿量增加，符合糖尿病三多一少的症状，且胰岛 细胞破损明显，导致糖尿病模型组小鼠的FBG明显高于正常对照组;经过28 d的灌 胃治疗，拐枣多糖治疗组不同程度降低了小鼠的FBG，高剂量治疗组的降糖效果 显著;拐枣多糖处理降低了小鼠HbA1c含量，并作用效果与二甲双胍组接近;与正 常组相比，糖尿病模型组小鼠 TC和TG浓度显著升高，HDL的含量有所下降， 与糖尿病模型组相比，拐枣多糖各剂量组均能使糖尿病小鼠血清中G、TC含量降 低，同时提高HDL含量，说明能够改善糖尿病小鼠血脂代谢紊乱的情况;拐枣多 糖高剂量治疗后主动脉内膜相比模型组较完整平坦，内皮黏附及浸润于内膜的单 核细胞明显较少，内膜增厚明显轻于模型组，说明拐枣多糖可以调节降低糖尿病 小鼠血脂，对糖尿病小鼠的血管并发症有一定的改善作用，对治疗高脂血症、预 防动脉粥样硬化、冠心病等方面是具有广阔的开发前景的，有望成为一种新型调 节血脂的保健食品。本研究中一次性灌服拐枣多糖最大剂量为 60000 mg/kg bw， 远远大于毒理学评价标准，说明拐枣多糖对小鼠安全无毒。正常组小鼠体质量随 时推移增加迅速，与正常组相比较，造模成功后的各组小鼠体形则明显消瘦，体 重逐渐变轻。表明拐枣多糖具有很好的促进糖尿病小鼠体重恢复的作用。虽然拐 枣多糖的降血糖作用不如口服降血糖药二甲双胍那么强，但其作用比较温和，不 会出现二甲双胍那样强烈的低血糖反应也是其突出的优点，用来开发无毒无副作 用的降糖替代药物具有重要意义。