【ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序】癌细胞基因

ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序

【关键词】 逆转录聚合酶链反应 western blot检测 双荧光素酶报告基因 分析 ezrin蛋白是erm (ezrin  radixin  moesin)家族成员之一, 主要参与细胞骨 架与胞膜之间的连接 [1]。研究证明，ezrin基因在食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、 前列腺癌以及其他多种肿瘤细胞中过表达[2  6]。wWw.133229.COM分析ezrin基 因的外显子、内含子以及转录起始位点上游3 000 bp以内的dna序列，结果发现， ezrin基因转录起始位点上游约1 600 bp的范围为高gc含量区，存在cpg岛，且含有 转录因子sp1的众多潜在结合位点。然而，ezrin基因在肿瘤细胞中的表达是否受 到cpg岛甲基化或转录因子sp1的调控，调控位点又在哪里？这些问题迄今仍不明 确。本研究对我们实验室现有的几种癌细胞进行ezrin基因表达检测，同时克隆 ezrin基因5′侧翼高gc含量区序列，检测此序列在癌细胞中的转录活力，为进一步 揭示ezrin基因在癌细胞中的表达调控机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 质粒、细胞系及主要试剂 质粒pgl3  basic (pglb)、pgl3  promoter (pglp)和prl  tk购自promega公司。

食管癌sheec细胞株为本实验室建立[7]，其余细胞株购自中国科学院细胞 库。trizol试剂、199培养基、dmem培养基购自invitrogen公司；
限制性内切酶、 逆转录系统试剂盒、pcr mix、双荧光素酶报告基因分析系统购自promega公司；

pvdf膜购自millipore公司；
ezrin ab  1（3c12）购自neo markers公司；
β  actin抗 体（ac  15）购自sigma公司；
标准蛋白分子量（sc  2035）、羊抗鼠igg  hrp （sc  2031）、化学发光试剂购自santa cruz公司。superfect转染试剂、质粒提取 试剂盒购自qiagen公司。其他常用试剂为国产分析纯试剂。

1.2 细胞培养 所有细胞均置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养。ec109（食管 癌）、ec171（食管癌）、ec8712（食管癌）、sheec（食管癌）、bgc823（胃癌）、 hela（宫颈癌）等细胞贴壁生长于含10%灭活小牛血清的199培养液中；
n87（胃 癌）、a549（肺癌）、95d（肺癌）、hepg2（肝癌）等细胞贴壁生长于含10%灭 活小牛血清的dmem培养液中。贴壁细胞培养成单层后，用0.25%胰蛋白酶（含 0.02% edta）消化，传代培养，待达到一定数目[（1～2)×107]后收获细胞。k562 （髓性白血病细胞株）细胞悬浮生长于含10%灭活小牛血清的rpmi199培养液中， 细胞密度保持在(0.1～0.5)×106 cells/ml，每3天传代一次，当密度达到(1.0～ 1.5)×106 cells/ml时收获细胞。

需要进行瞬时转染实验的细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl，细胞接 种密度为2×105 cells/ml。细胞置37℃培养，细胞满度约为50%～60％时，转染质 粒。

1.3 逆转录聚合酶链反应（rt  pcr） trizol试剂提取细胞总rna，经逆转录获得cdna。扩增ezrin基因部分序列的 上、下游引物分别为5′  cgggcgctctaagggttct  3′和 5′  tttcggtttctggtgagtatcctcgatccc  3′，扩增片段位于ezrin基因的+30/+134（转录起 始位点定义为+1）。扩增gapdh基因的上下游引物分别为 5′  gaaggtgaaggtcggagtc  3′和5′  gaagatggtgatgggatttc  3′，扩增片断位于gapdh 基因的+108/+333（转录起始位点定义为+1）。将两对引物放入同一pcr反应体系， 反应条件如下：94℃ 5min；
94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循环30次；
72℃ 5min。

扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，于fluorchem tmis  8900成像系统（alpha innotech, usa）分析成像，计算目的基因产物（ezrin）和内对照基因产物(gapdh) 的灰度比值。1.4 细胞总蛋白质的提取 收集细胞团块，用4℃预冷的pbs（0.01 m, ph 7.2～7.4）重悬细胞，每瓶细 胞（30cm2的培养瓶）加400μl裂解液（50mm tris.hcl ph 8.0, 150mm nacl, 1% triton x  100, 100μg/ml pmsf），于冰上裂解30min，4℃下12 000r/min离心5min。离心 后的上清即为细胞总蛋白。

蛋白含量的测定采用bradford法。

1.5 western blot分析 50μg细胞总蛋白提取物进行12％ sds  聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白电转 至pvdf膜上，5％脱脂奶粉封闭1h；
加入鼠抗ezrin抗血清和鼠抗β  actin抗血清， 室温孵育1h，pbst（0.01 m, ph 7.2～7.4，0.05％ tween 20）洗2次，pbs洗1次；
再 加入羊抗鼠igg  hrp，室温孵育1h，pbst洗2次，pbs洗1次；
最后加入western blot 化学发光试剂，于fluorchem tmis  8900成像系统（alpha innotech, usa）进行成像 分析，计算ezrin和对照β  actin的灰度比值。

1.6 ezrin基因5′侧翼区序列的克隆 扩增ezrin基因5′侧翼区序列的下游引物为 5′  cccaagct+134ttcggtttctggtgagta  tcctcgatccc  3′(下划线为hindⅲ酶切位点；

ezrin基因转录起始位点定义为+1，翻译起始位点在+135，碱基所在位置标注在 右上角)；
利用软件primer premier 5.0设计上游引物 5′  t-1529taaccagagcttcggaaaggcgg  3′。扩增片段包含了ezrin基因翻译起始位点 上游的高gc含量区。以食管癌细胞基因组dna为模板进行pcr扩增，反应条件为：
94℃ 5min；
94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min，循环30次；
72℃ 5min。扩增片 段中含有stuⅰ酶切位点aggcct，位于在ezrin基因的-1447/-1442处，将扩增产物经 stu ⅰ/hindⅲ双酶切，定向连接至经smaⅰ/hindⅲ双酶切不含启动子的萤火虫荧 光素酶报告基因表达载体pglb上，构建重组质粒pglb  he(-1444/+134)。采用kpn ⅰ/hindⅲ双酶切鉴定重组质粒，同时进行dna测序分析。

1.7 瞬时转染 提取质粒并测定其含量。用buffer eb（qiagen公司质粒提取试剂盒中提供） 将实验质粒pglb、pglp、pglb  he(-1444/+134)稀释至100ng/μl，内参照质粒prl  tk稀释至20ng/μl，然后将实验质粒分别与prl  tk按50∶1混合，即1μg∶0.02μg。具 体转染步骤参照superfect转染试剂操作手册进行。转染后48h后，收获细胞。每 组实验样品3个平行实验孔，并至少进行3 次重复实验。

1.8 双荧光素酶活性检测及统计学分析 参照双荧光素酶报告基因分析系统操作手册，在td20/20照度计（turner designs公司）上进行双荧光素酶活性检测。根据td20/20型照度计配置的软件包计 算出各组转染细胞的相对荧光素酶活性（萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶），以 此代表实验质粒启动子的转录活力。各组实验数据均计算平均值及标准差。应用 ssps13.0软件对各组实验数据之间差异是否有统计学意义进行t检验。

2 结果 2.1 ezrin基因在几种癌细胞中的mrna表达 rt  pcr扩增ezrin基因片段的长度为105bp，扩增gapdh片段的长度为226bp。

电泳结果显示，在所检测的食管癌等11种癌细胞中均有两条特异性扩增条带，且 条带位置与预期相符，阳性率为100%。利用fluorchem tmis  8900成像系统分析 扩增条带的灰度值。gapdh为看家基因，在各种组织和细胞中的表达相对稳定， 以gapdh的扩增产物作为对照，计算各细胞ezrin基因与gapdh基因扩增产物的比值， 将食管癌细胞ec109的ezrin/gapdh灰度比值定义为1，其他癌细胞与ec109比较。可 以看出，与已经被证实高表达ezrin基因的ec109相比，所检测的其他几种癌细胞 ezrin基因mrna的表达水平在0.77～1.07之间，见图1。

2.2 ezrin蛋白在几种癌细胞中的表达 ezrin蛋白分子量为82 kda。β  actin是肌动蛋白的一种，分子量为42kda， 在各种组织和细胞中的表达相对稳定，在此作为内对照。细胞总蛋白western blotting检测结果显示，在所检测的几种癌细胞中均有ezrin蛋白表达。利用 fluorchem tmis  8900成像系统分析蛋白条带，计算各癌细胞ezrin和β  actin的灰 度比值，将食管癌细胞ec109的ezrin/β  actin比值定义为1，其他癌细胞与ec109 比较。可以看出，与ec109相比，所检测的其他几种癌细胞ezrin蛋白的表达水平 在0.79～1.32之间，见图2。

m: dna marker;
1: ec109;
2: ec171;
3: ec8712;
4: sheec;
5: n87;
6: bgc823;
7: hela;
8: a549;
9: 95d;
10: hepg2;
11: k562图1 ezrin基因mrna在几种癌细胞中 表达的rt  pcr检测 m: protein marker;
1: ec109;
2: ec171;
3: ec8712;
4: sheec;
5: n87;
6: bgc823;
7: hela;
8: a549;
9: 95d;
10: hepg2;
11: k562 图2 ezrin蛋白在几种癌细胞中 表达的western blotting检测 2.3 ezrin基因5′侧翼区序列的克隆鉴定 含有ezrin基因-1444/+134序列的重组质粒pglb  he(-1444/+134)的kpnⅰ /hindⅲ双酶切鉴定结果显示，重组质粒所连接的外源片段长度与预计值一致。质 粒测序结果也证实所克隆序列为ezrin基因5′侧翼区序列（genbank登录号：
ef184645），见图3。

2.4 ezrin基因-1444/+134序列在几种癌细胞中的转录活力 质粒pglb、pglp和pglb  he(-1444/+134)分别与内参照prl  tk共转染ec109、 hela、a549和bgc823细胞。以含sv40启动子的质粒，pg4的相对荧光光素酶活性为 1来计算同一细胞系中pglb和pglb  he(-1444/+134)的相对酶活性。结果显示，在 所检测的几种癌细胞中，不含启动子序列的pglb基本不表现荧光素酶活性（相对 值为0.01～0.03）；
以ezrin基因-1444/+134序列作为启动子的pglb  he(-1444/+134) 表现出较强的荧光素酶活性，是pglp的4～10倍，见图4。这说明，ezrin基因的 -1444/+134序列在癌细胞中具有很强的转录活力，有可能是调控ezrin基因转录的 重要区域。

3 讨论 ezrin蛋白是一种磷酸化蛋白质，主要表达于各种类型的上皮细胞及某些非 上皮细胞，具有广泛的生理功能。我们曾研究发现[2,8]，ezrin基因在永生化食管 上皮细胞恶性转化为食管癌细胞过程中显著异常过表达，通过rnai手段下调ezrin 基因的表达可以有效阻止食管癌细胞的移动、侵袭等肿瘤细胞生物学行为，在临 床食管癌组织中发生明显的ezrin蛋白移位表达现象，提示ezrin是食管癌转移侵袭 相关基因。

ezrin基因5′侧翼区存在cpg岛和转录因子sp1的众多潜在结合位点，为了明确ezrin基因的表达是否受其5′侧翼区序列调控，我们首先检测了实验室现有几种 细胞株的ezrin基因表达情况，结果发现，ezrin基因在所检测的几种癌细胞中均有 高水平表达。由于没有明显低表达ezrin基因的细胞株，甲基化实验暂时无法进行， 不能确定是否存在5′侧翼区cpg岛甲基化调控ezrin基因的表达。然而，-1444/+134 序列的报告基因检测结果显示，ezrin基因5′侧翼区序列具有很强的转录活力，很 可能对ezrin基因在癌细胞中的高表达起重要作用。近期，我们针对ezrin基因在食 管癌细胞中的转录调控进行了深入研究，结果发现，在ezrin基因-1444/+134序列 中含有增强子区和基本启动子活性区，对基本启动子活性起重要调控作用的元件 包括一个经典的sp1结合位点（-75/-69）和一个经典的ap  1结合位点（-64/-58）。

过表达c  fos能够提高ezrin基因基本启动子活性；
sp1特异性化学抑制剂 mithramycin a能够阻断核蛋白因子与含有sp1位点的dna序列的结合，同时降低 ezrin基因基本启动子活性。我们认为在食管癌细胞中，转录因子sp1和ap  1共同 调控ezrin基因的基本转录活性（另文发表）。ezrin基因在其他癌细胞中是否具有 相同的转录调控机制，还需进一步研究。