小鼠缺血再灌注_探究长春西汀对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

探究长春西汀对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

1 材料与方法 1.1 材料 健康雄性昆明白小鼠，体质量30～40g(滨州医学院动物实验中 心)。长春西汀注射液购自山东瑞阳制药有限公司。小鼠肿瘤坏死因子(TNF-)、 白细胞介素-1(IL-1)、IL-6酶联免疫吸附试验试剂盒购自达科为生物技术有限公司。

超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

BCA蛋白水平测定试剂盒购自烟台赛尔斯生物技术有限公司。

1.2 方法 1.2.1 动物分组和模型制备 将小鼠分成4组：(1)假手术组(n=8);(2)IR组 (n=8);(3)长春西汀低剂量干预组(n=8);(4)长春西汀高剂量干预组(n=8)。小鼠用氯 胺酮/甲苯噻嗪(80/10mg/kg)腹腔麻醉后仰卧在手术台上，腹部备皮、消毒后正中 切口，游离左右肾蒂，假手术组不夹闭，其余3组分别用无损伤血管夹夹闭，45min 后松开恢复血流，以肉眼观察肾脏颜色变化来判断肾脏缺血或再灌注是否成功。

长春西汀低剂量和高剂量干预组分别在术前1h腹腔注射长春西汀10mg/kg和 20mg/kg;假手术组和IR组同时给予等量生理盐水。再灌注24h后打开腹腔，下腔 静脉取血分离血清，取一部分肾组织Bouin氏液固定，剩余肾组织用冰磷酸盐缓 冲液漂洗后-70℃保存。

1.2.2 组织学评价 取小鼠肾组织，Bouin氏液固定24h，常规制备石蜡切片， 脱蜡水化后用 HE试剂盒染色，光镜下观察肾脏的组织形态变化。

1.2.3 血清指标检测 血清中肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平采用全自动生化 分析仪(美国德灵 Dimension RXL Max)测定。按照ELISA试剂盒说明书检测血清 中TNF-、IL-1、IL-6水平。1.2.4 肾组织中 MDA水平和SOD活性检测 称1g肾组织，放入玻璃匀浆器 中，加冷生理盐水在冰上研磨成10%的组织匀浆，3 000r/min低温离心10min后取 上清液，分别按照试剂盒操作步骤对 MDA水平和SOD活性进行检测。蛋白浓度 用BCA蛋白水平测定试剂盒检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0统计学软件进行分析，计量资料采用xs表 示，多组数据间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD法，以P0.05 为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 肾组织形态学变化 见图1。HE染色可见假手术组肾小球和肾小管结构 正常，发现IR组肾小管排列紊乱，管腔扩张，部分刷状缘消失;肾小管上皮细胞 肿胀，坏死;管腔内可见管型;肾间质炎症细胞浸润。长春西汀干预后肾组织病理 损伤减轻，其中高剂量干预组损伤改善更显著，可见肾小管结构完整，排列整齐， 管腔内管型减少，炎症细胞少见。

2.2 4组肾功能指标变化 见表1。与假手术组相比，IR组SCr和BUN水平明 显升高，差异有统计学意义(P长春西汀干预组SCr和BUN与IR组比较明显降低， 差异有统计学意义(P长春西汀高、低剂量干预组SCr和BUN差异也有统计学意义 (P0.05)。

2.3 血清中 TNF-、IL-1、IL-6结果比较 见表2。与假手术组相比，小鼠肾 IR可引起细胞因子TNF-、IL-1和IL-6表达升高，差异有统计学意义(P0.05)。用长 春西汀预处理后，与IR组相比，TNF-、IL-1和IL-6表达明显降低，差异有统计学 意义(P0.05)，高剂量组降低更显著，与低剂量组相比差异有统计学意义(P0.05)。

2.4 肾组织中 MDA水平和SOD活性变化 见表3。与假手术组比较，IR组 肾组织中 MDA水平明显升高，差异有统计学意义(P0.05)，SOD 活性明显降低， 差异也有统计学意义(P长春西汀低剂量干预组与IR组相比，MDA 水平降低，差 异有统计学意义(P0.05)，SOD活性虽有所升高，但差异无统计学意义(P高剂量干 预组与IR组相比，MDA水平降低，差异有统计学意义(P0.05)，SOD 活性升高， 差异有统计学意义(P0.05)。

3 讨论本研究采用夹闭双侧肾蒂造成肾缺血45min再恢复血供的方法建立小鼠肾 IR损伤模型。术后24h，IR组小鼠SCr和BUN升高，肾组织病理损伤明显，提示 肾脏IR模型制备成功。给予长春西汀干预后，SCr和BUN水平降低，肾组织病理 损伤减轻，由此提示长春西汀干预处理可以改善肾IR损伤程度。肾IR损伤中有众 多的炎症介质和免疫因子参与，TNF-、IL-1和IL-6表达升高已经成为肾IR 炎症 的重要标志。TNF-是活化单核细胞产生的多活性细胞因子，其能刺激单核巨噬 细胞合成和分泌IL-1和IL-6等炎症因子。本研究中IR组TNF-、IL-1和IL-6表达升 高，证明有炎症参与了组织损伤。长春西汀干预组相对IR组 TNF-、IL-1和IL-6 表达降低，提示长春西汀可以通过抑制炎症改善肾IR损伤。研究表明，长春西汀 作为磷酸二酯酶抑制剂，能够抑制炎症相关因子，如核转录因子NF-B和TNF-的 表达，从而降低IL-1、IL-6和IL-8等炎症因子的表达，起到保护组织的作用。氧 自由基的生成被认为是IR损伤中最重要的发病机制之一。大量氧自由基能够攻击 细胞膜的脂质和蛋白质，导致脂质过氧化，破坏组织的结构和功能。MDA是脂 质过氧化的产物之一，能够直接反映组织损伤程度。SOD是一种重要的抗氧化酶， 能够保护细胞免受氧自由基的攻击。本研究中与假手术组相比，小鼠IR后肾脏中 MDA 水平升高，SOD活性降低，表明肾IR后氧自由基产生增多，损伤了肾小管 上皮细胞。有研究表明，长春西汀另一个保护作用机制就是它能够清除羟自由基 和其他活性氧而发挥显著的抗氧化活性，这与本研究结果相符。

本研究发现，长春西汀干预组肾组织SOD活性升高，MDA水平有所降低， 由此表明长春西汀能够保护内源性SOD活性，抑制脂质过氧化，从而发挥保护作 用。综上所述，长春西汀干预处理能够降低小鼠肾IR后的炎症和氧化损伤，保护 肾功能，为临床预防治疗急性肾损伤提供了新思路。