【谈补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血损伤血脑屏障的影响】 大鼠缺血再灌注

谈补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血损伤血脑屏障的影响

1 实验材料 1.1 动物 健康雄性SPF 级SD 大鼠64 只,12 周龄,体质量(28020)g,购于中国人民解 放军军事医学科学院动物中心,许可证号：SCXK(军)2004-2009。

1.2 药物与试剂 补阳还五汤由黄芪120 g、当归6 g、川芎3 g、地龙3 g、赤芍5 g、红花3 g、 桃仁3 g 组成,北京大学医学院提供,经水煎、浓缩制成1 g 原药材/mL的溶液;
2,3,5- 三苯基氯化四氮唑(TTC) ：
美国(aMResco 公司,批号0765)。大鼠MMP-2、 MMP-9、VEGF、vWF ELISA 试剂盒：美国RB 公司,规格96T,购于北京尚柏试 剂有限公司(批号分别为63120912、28120811、27121009、52121203)。

1.3 主要仪器 电子分析天平(AE160 型,瑞士Mettler 公司),手术显微镜(SXP-1B,上海医 用光学仪器厂),1411 型高频小电刀(上海医疗器械技术公司),低温高速离心机 (Sigma 公司),光学显微镜(日本OLYMPUS 公司),切片扫描仪(蔡司光学仪器有限 公司),显微图像分析系统(日本尼康公司)。

2 实验方法 2.1 造模根据Longa 等报道的线栓法建立大鼠永久性脑缺血模型。10%水合氯醛溶 液(0.35 mg/kg 体质量)腹腔注射麻醉后将大鼠仰位固定,常规碘酒、酒精消毒颈部 皮肤。颈部正中作约2.5 cm 切口,暴露左侧颈动脉三角,在手术显微镜下逐层分离 组织,剥离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。电刀凝闭ECA 的分支甲状腺动脉、ECA 与ICA 之间的枕动脉,结扎游离ECA 主干,分离ICA 主 干至翼腭动脉(PPA),用无损动脉夹分别夹闭CCA、ICA 和PPA,用虹膜剪在ECA 残端剪一楔形小口,由此插入钓鱼线(直径0.25 mm,头端呈直径约0.3 mm 的圆球 形),轻推钓鱼线使之由ECA 通过分叉部进入ICA,至大脑中动脉的起点,阻断大脑 中动脉的血液供应。尼龙线插入深度由分叉处计算约18～22 mm。缝合颈部切口, 假手术组手术过程与模型组相同,分离出左侧CCA 及ECA、ICA,仅结扎ECA。用 缝合线结扎ECA 残端,剪断多余栓线,术区使用青霉素粉少许,逐层缝合手术切口。

待清醒后,参照Bedersont 等的评分方法,3 分者为造模成功。假手术组手术过程与 模型组相同,但只结扎ECA远心端,不插入栓线阻塞血管。

2.2 分组与给药将造模成功的大鼠按照神经功能评分均匀分组,分为模型 组和补阳还五汤组。补阳还五汤组大鼠给予补阳还五汤水煎液,给药剂量为1.26 g 原药材/100 g体质量(相当于临床成人日用量的6.3 倍),造模后24 h 立即灌胃,之 后每日称大鼠体质量,计算给药量,于相同时间点给药1 次;假手术组和模型组给 予等量生理盐水。连续给药6 d,第7 日进行神经功能评分并处死取材。2.3 检测 方法及观察指标2.3.1 神经功能评分 参考Bederson 等方法,总分10 分。

①提鼠尾,观察右前肢表现。1 分：内收,但不贴身;2 分：内收,贴于身体;3 分：内收贴于身体并踡缩;4 分：大鼠躯体向右侧旋转。

②评价两前肢肌张力：将动物置于一金属网上,向后轻提鼠尾,观察两侧前 肢肌张力。0 分：两侧前肢紧拉金属网肌力无明显差别者;1 分：右前肢拉金属 网但肌力明显弱于左侧;2 分：右前肢不能拉金属网。

③将动物置一光滑平面,观察侧向推挡阻力。0 分：双侧推挡阻力无明显 差别;1 分：右侧推挡阻力明显弱于左侧;2 分：右推大鼠时其向右侧倾倒。

④大鼠左眼上睑下垂,左眼分泌物增多者评2 分。以上4 项评分相加为最 后神经功能评分。

2.3.2 大鼠脑梗死体积检测造模后第7 日,将麻醉大鼠断头取全脑后迅速放于-20 ℃冰箱中冻存15 min后,距额极2 mm 开始,以视交叉水平为中心,间隔2 mm做连续冠状切片,每个 脑块切5 片,迅速投入5 mL1%TTC 溶液中,置37 ℃孵箱孵育30 min,避光。正常脑 组织染成红色,缺血区呈灰白色。TTC 染色均匀后取出脑组织,放置于盛有4%多 聚甲醛液的小瓶内,固定24 h,取出后滤纸吸干表面水分,用扫描仪扫出图片,计算 梗死体积占大脑半球体积的百分比。

2.3.3 大鼠脑组织及微血管的形态观察 造模后第7 日,大鼠灌注后断头取脑,置于4 ℃、4%中性多聚甲醛固定液 (pH 7.2～7.6)固定24 h 后,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,于视交叉前缘开始作5 m 厚冠状切片。常规脱蜡水化,行HE 染色,中性树胶封片。光镜下观察脑组织及微 血管形态学改变。

2.3.4 大鼠血清中血管性血友病因子及脑组织中基 质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子的含量测定 造 模后第7 日,将动物麻醉,自腹主动脉采血,静置30 min 后离心取上清冻存备用。再 取脑分离出左侧(患侧)半球放于冻存管置液氮中,检测前以生理盐水制成10%脑 组织匀浆。取制备好的血清及脑组织匀浆,按照试剂盒说明操作。

3 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件进行分析。实验结果均以xs 表示,数据资料经正 态性分布检验及方差齐性检验后,采用方差或非参数检验比较组间差异。P 0.05 表示差异有统计意义。

4 结果 4.1 补阳还五汤对大鼠神经功能评分的影响 动物苏醒后,模型组和补阳还五汤组都存在明显神经功能缺损,神经功能评 分差异无统计学意义(P 假手术组未见神经功能缺损。灌胃6 d 后,模型组神经功 能评分略增高,但前后比较差异无统计学意义(P 补阳还五汤组神经功能评分显 著降低,与模型组比较差异有统计学意义( P 0.01),提示补阳还五汤能够促进大鼠 的神经功能恢复,减轻缺损程度。各组大鼠神经功能评分。4.2 补阳还五汤对大鼠脑梗死体积的影响 TTC 染色结果表明,假手术组脑片均红染,无白色梗死灶形成。模型组大鼠 梗死灶位于缺血侧脑组织基底节区和额顶部外侧皮层,脑梗死灶明显。补阳还五 汤组脑梗死体积显著减小,与模型组比较差异有统计学意义(P 0.05)。

4.3 病理观察结果 假手术组大鼠脑组织结构完整,灰白质边界清楚,皮质各层细胞分布基本正 常;神经元排列整齐且形态多样,胞核较大、居中、着色浅、核仁清晰、胞质深染;
脑微血管内皮细胞结构完整、连接紧密,未见炎细胞浸润、充血及水肿。模型组 脑组织可见梗死灶,灶内结构疏松,呈水肿样,神经元丢失明显,残存的神经元细胞 核固缩、浓染;脑微血管内皮细胞受损,可见炎细胞浸润,嵌塞。补阳还五汤组脑组 织病理变化较模型组减轻,梗死灶体积较模型组缩小,水肿情况减轻;存活的神经 元数目有所增加,血管内皮细胞受损较模型组减轻,有少量炎性细胞浸润;半暗区 损伤亦有所改善。

4.4 补阳还五汤对大鼠血清中血管性血友病因子及脑组织中基质金属蛋 白酶-2、基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子含量的影响 与假手术组比较,模型组VEGF、MMP-2、MMP-9 及vWF 含量显著增加(P 0.01,P 与模型组比较,补阳还五汤组VEGF、vWF、MMP-9 及MMP-2 含量显著 降低(P 0.01,P 0.001)。提示脑缺血7 d 后,模型组脑组织中VEGF、MMP-2、MMP-9 及血清中vWF 均增高,补阳还五汤能阻抑其表达。

5 讨论 现代研究表明,补阳还五汤可增强微血管应激能力,缓解微血管痉挛,减轻 其损伤程度,使微血管密度及微血管面积比增加,减轻缺血损伤。本实验结果表明, 给永久性脑缺血动物补阳还五汤后,神经功能缺损明显改善,脑梗死体积显著减小。

血脑屏障破坏可导致血管源性脑水肿和脑疝的发生,造成病情的恶化。

故减轻缺血对血脑屏障造成的损伤,保护脑组织,成为治疗的一个重要靶点。

脑组织中细胞外基质(ECM)是维持血脑屏障结构完整性的重要组成部分,而 MMPs 激活后能够降解ECM 成分。MMPs 是一组Zn2+、Ca2+依赖性的蛋白水 解酶,正常时以酶原形式存在,在一些生理和病理条件下被激活,参与组织的损伤 和修复。在脑缺血损伤中起重要作用的是MMP-2 和MMP-9,可降解ECM、破坏脑血管外基底膜主要成分,从而破坏血脑屏障、改变毛细血管通透性导致血管源 性脑水肿甚至出血性转化,还可使炎性细胞浸润至脑组织,引发一系列炎症反应。

脑缺血后MMP-2 表达增加与早期神经元的损伤有关,MMP-9 表达增加与脑梗死 后出血转化有关。MMP-9 水平的上升出现在缺血性脑卒中早期或急性期,导致血 脑屏障的破坏,进一步促使神经炎症反应和神经细胞的继发性死亡。Higashida J 等研究发现,通过提高缺氧诱导因子-1(HIF-1)、水通道蛋白4(AQP4)、MMP-9 的 表达可以降低血管基底膜蛋白表达和紧密连接蛋白的表达,加重脑水肿,通过抑制 HIF-1、MMP-9 的表达,降低血脑屏障的通透性,但不受AQP4 的影响。Romanic 等[6]则发现应用MMP-9 单克隆抗体,梗死灶缩小了29.9%。因此我们推测,早期选 择性抑制MMP-2、MMP-9 可显著减轻脑梗死。

本实验采用酶联免疫法检测了脑组织中MMP-2、MMP-9 蛋白表达情况, 在假手术组仅有少量表达,与文献报道基本一致[9-10],脑缺血后MMP-2、MMP-9 蛋白表达量显著增加,应用补阳还五汤干预后,二者水平均显著下降,提示补阳还 五汤可以通过抑制MMP-2、MMP-9 表达,保护血脑屏障,减轻脑损伤。内皮细胞 是构成血脑屏障的主要物质基础。循环中的vWF 主要来自血管内皮细胞,内皮细 胞受损则合成和释放vWF 增加,内皮细胞损伤越严重,则血浆中vWF 水平越高。

vWF 可加速血小板黏附、聚集,介导血小板释放相关因子,干扰纤溶过程,促进血 管平滑纤维化、动脉粥样斑块及血栓形成,且与疾病的轻重呈正相关。因此,vWF 被认为是心血管疾病的一个高危因素,并被作为血管内皮细胞损害的标志物。本 实验脑缺血后大鼠血清中vWF 表达增高,补阳还五汤显著减少了其表达,说明补 阳还五汤可以保护内皮细胞,从而维持血脑屏障结构的完整性。

VEGF 是另一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能因子,是内皮细胞特 异性的促有丝分裂源,能促进内皮细胞分裂、增殖增生和转移,它在血管生成的各 个阶段均发挥着重要作用,是目前公认的血管新生中最关键的因子。本实验假手 术组VEGF 有少量表达,模型组VEGF 表达量增高,这可能是缺血性脑损伤诱导 VEGF 基因早期表达的缘故;应用补阳还五汤干预后,VEGF 显著降低,笔者认为, 这可能和VEGF 的动态表达有关。因此,可以推测,补阳还五汤可通过多环节调节 VEGF,保护血脑屏障。

目前,西医治疗脑缺血及其后遗症尚无突破性进展,而中医药防治脑缺血具 有很大潜力。本实验显示,补阳还五汤能改善神经功能缺损,减少脑梗死体积,其发 挥作用的机理可能是通过抑制MMP-9、MMP-2、vWF的表达而保护血脑屏障,也 可能是通过调控VEGF、vWF等内皮活性因子,改善微循环,促进脑血流的恢复。