【研非复制性腺病毒携带AT2】诺如病毒

研非复制性腺病毒携带AT2

因此，本课题的目的是利用非增殖腺病毒作为载体携带全长抗体基因在体 内表达全长抗体，这样可以避免在体外用哺乳动物细胞表达抗体，以及纯化等复 杂而且昂贵的规程。AT2是一个对肿瘤有明显疗效的抗EGFR 单克隆抗体 Cetuximab。由于EGFR 在很多肿瘤中都有过量表达，在肿瘤的发生、生长、抗 药性和转移性中都起到了重要的作用。Cetuximab 对过量表达EGFR 的肿瘤有良 好的治疗作用，现已被批准用于头颈癌、直肠癌和肺癌的治疗，无论是单独使用 还是与其它药物联合应用都有很好的效果，只有很小的副作用，出现严重反应的 概率不及万分之一。Cetuximab 单抗应用其它肿瘤治疗的研究也在大力的开发中， 在肿瘤的治疗中有很大应用前景，但是由于其生产成本过高，国内普通患者难以 承担，而抗体基因治疗正好解决了这个问题。本研究根据人体内密码子的偏爱性 选择修改了部分氨基酸密码子，构建了修改密码子后的重组腺病毒载体。体外实 验表明，通过修改密码子后提高了抗体的表达量，通过Western 和IFN 实验检验， 无论修改密码子与否，重组腺病毒在293 细胞中表达的抗体与商品化的 Cetuximab 单抗相近的特性，分子量大小一致，与抗原EGFR 有很好的结合，说 明我们构建的载体表达的抗体是有活性的。

1. 材料和方法 1.2.1 细胞培养A431 细胞、SK-Br-3 细胞和293 细胞在5%CO2，37℃ 条件下培养，培养液为含10%FBS的DMEM。

腺病毒载体我们首先分别合成修改密码子前后的AT2 抗体基因的轻链及 重链，且在轻链及重链前面各自合成抗体的信号肽基因，用IRES 元件连接抗体 的轻链和重链基因，以实现AT2 抗体的重链和轻链的平衡性及完整性，经PCR 引入酶切位点后，逐步把重轻链基因装入载体pDC339 中。

2. 结果 腺病毒穿梭载体pDC339-AT2 和pDC339-NAT2 的酶切和PCR 鉴定结果。

用双夹心 ELISA法测定病毒抗体的表达量：Ad-AT2 与Ad-NAT2 相比的 表达量分别是：
25.2±5ng/ml 和285.3±5ng/ml，通过修改密码子较大的提高了抗体的表达 量。

3 讨论 治疗各种疾病、顽症中有巨大的优势，但是由于其自身的某些性质，加上目 前我们的生产抗体的技术和工艺，限制了抗体的应用。在当前的生产抗体的工艺 比较复杂，需要综合多项技术，工艺和技术都被少数公司垄断，而且抗体的需要 量也在增大，最后导致抗体的治疗成本极高。

为了降低成本和提高抗体治疗效果，基因治疗是一种新型有效的手段，我 们可以通过把全长抗体基因装入载体，通过载体带进体内，是抗体在体内表达。

这样既可以免去体外生产抗体众多复杂的过程，降低成本，又可以使抗体更好的 在体内持续作用，更好的到达组织。

因此，如何找到一个安全的，有效的载体是关键。腺病毒成为一个重要的 载体，由于我们对其研究得比较清楚，我们对其进行改造，删除负责病毒复制的 E1A 区以及其它多余的区域。

腺病毒作为载体应用于基因治疗中有众多优点，在目前的条件下，腺病毒载体相对于其它载体，更适合作为基因治疗的载体。

根据密码子的偏爱性，我们收集了高表达的氨基酸密码子，修改了部分抗 体基因的密码子，以此来提高抗体的表达量。经Western 鉴定和IFN 实验证明腺 病毒载体表达的抗体是完整和有活性的，特异性也很好，可以应用下一步的治疗 研究。