树突状 探讨聚肌胞联合E7免疫对宫颈癌患者树突状细胞的影响

探讨聚肌胞联合E7免疫对宫颈癌患者树突状细胞的影响

2.2 检查项目及方法 2.2.1 DC 的分离和培养 2.2.2 MTT 实验 2.2.3 流式细胞技术 2.3 统计分 析 计量资料用±S 表示，组间差异采用ANOVA 及q 检验分析。P 0.05 认为统 计学上有显著意义，统计学处理采用SPSS 13.0 软件。

3 结果 3.1 DC 的比例及增殖反应 3.2 DC 的CD11c+/CD86+表达 DC 的 CD11c+/CD86+表达 A：C 组DC 在加入培养液后CD11c+/CD86+的表达；
B：C 组DC 在加入聚肌胞后CD11c+/CD86+的表达；
C：C 组DC 在加入聚肌胞联合 E7(44-62)后CD11c+/CD86+的表达；
D：CIN 组DC 在加入培养液后 CD11c+/CD86+的表达；
E：CIN 组DC 在加入聚肌胞后CD11c+/CD86+的表达；

F：CIN 组DC 在加入聚肌胞联合E7(44-62)后 CD11c+/CD86+的表达；
G：宫颈 癌组DC 在加入培养液后CD11c+/CD86+的表达；
H：宫颈癌组DC 在加入聚肌 胞后CD11c+/CD86+的表达；
I：宫颈癌组DC 在加入聚肌胞联合E7(44-62)后 CD11c+/CD86+的表达。宫颈癌组DC 的CD11c+/CD86+的表达水平显著低于C 组和CIN 组（P0.01，P0.05），C 组CD11c+/CD86+的表达水平显著高于CIN 组 （P0.05）。与聚肌胞组比较，聚肌胞联合E7(44-62)刺激能够显著提高宫颈癌患 者外周血的DC 的CD11c+/CD86+表达水平(P 值分别0.01，0.05)。

4 讨论 E7 基因是引起宫颈上皮细胞恶变最重要的癌基因之一，所编码的E7 蛋白 是宫颈癌特异性抗原。因此，E7 蛋白适于作为宫颈癌疫苗的抗原物质[5]，但单 独免疫后往往无法产生有效的抗宫颈癌免疫应答，其较弱的免疫原性及主要组织 相容性抗原（MHC）限制性（即必须与MHC 类分子结合后才能被具有相同MHC 表型的免疫细胞所识别）是抑瘤失败的主要原因[6,7]。聚肌胞是一种人工合成的双链RNA，和来源于病毒感染的双链RNA 具有类 似的抗病毒和抗肿瘤功能。聚肌胞是Toll 样受体3 的配体，Toll 样受体3 在人 和动物髓样DC、T 细胞、纤维原细胞内同时表达，聚肌胞与Toll 样受体3 结合 能够诱导大量的IFN-α和IFN-β[8]，后者具有广谱抗病毒作用。聚肌胞增强CD8+ T 细胞的功能，而且通过抑制凋亡延长CD8+ T细胞的存活；
还能够增加活化CD4+ T 细胞的存活率；
源自黑色素瘤特异性抗原的MHCⅠ类多肽和聚肌胞联合免疫 小鼠后，能够明显增加抗原特异性CD8+ T 细胞的数量和IFN-γ、TNF-a 的释放， 并且还抑制黑色素瘤细胞的生长[9,10]。聚肌胞能够增强免疫反应性、促进具有 MHCI、II 类表型T 细胞的存活/功能以及促进DC 成熟和增加抗原呈递能力的特 性[11]。

DC 是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，数量极少，仅占外周血单 核细胞的1％以下，能有效地激发静息的T 细胞活化和增殖反应，很少量的DC 就 能够启动快速、强大的免疫反应。本研究中，宫颈癌患者DC 的比例明显减少， 而且增殖反应明显减弱，提示宫颈癌患者不仅存在DC 数量的减少，而且DC 的 增殖功能也发生障碍。CD 11c 和CD 86 分别是活化DC表达的粘附分子和协同刺 激分子，同时表达（CD11c+/CD86+）是成熟DC 的特异性标志，具备高效的抗 原递呈功能。宫颈癌患者DC 的比例明显减少、增殖和活化出现明显缺陷，推测 宫颈癌通过使体内DC 数量下降，增殖障碍，成熟受限，从而下调或抑制DC 的 抗原提呈及免疫启动和维持功能导致肿瘤免疫逃逸的发生。现已证实，肿瘤不但 干扰DC 发育的多个环节，还可以直接诱导DC 凋亡， 导致数量减少。Akt 是 “ 细胞生存通路PI3K（phosphatidylinositide-3"-OH kinase ，PI3K）/Akt”关键分子， 活化的Akt 能够磷酸化下游多个凋亡相关底物如Bcl-2 家族、凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族、Foxo 家族、Caspase-3、Caspase-9 等， 通过上述调控机制发挥强大的抑制凋亡作用。Pirtskhalaishvili 等[12]将小鼠DC 与前列腺癌细胞株共同培养48 小时，导致DC 凋亡明显增加达53.66 ％，而对 照组只有17.71 ％；
通过Bcl-xL 转染DC 或IL-12 刺激方式，DC 表达Bcl-xL 增 加，后者阻断肿瘤的促DC 凋亡作用，使DC 数量增加并产生明显的抑瘤效果， 同时发现Fas/FasL 通路与DC 凋亡无关。Caspase 家族蛋白酶位于PI3K/Akt 通 路的下游，诱导凋亡时需要解除IAP 对Caspase 的抑制作用，其中Caspase-3 与 DC 凋亡的关系最直接和密切，是诱导凋亡的重要因子。通过研究胞嘧啶鸟嘌呤 二核苷酸（CpG DNA）抑制小鼠DC 凋亡的机制，发现Bcl-2 和Bcl-xL 表达的 高低不影响DC 凋亡的水平，说明Bcl-2 和Bcl-xL 不是调控DC 凋亡的主要因 子；
CpG DNA 通过上调PI3K 依赖性凋亡抑制蛋白cIAP 1（cellular inhibitor of apoptosis proteins ，cIAPs）的表达和下调Caspase-3，从而抑制DC 的凋亡和增 加DC 的数量，认为PI3K/Akt 是抑制DC 凋亡的重要途径[13]。本研究发现，聚肌胞联合E7(44-62)刺激能够显著改善DC 增殖功能、增加细胞数量、提高其 CD11c+/CD86+表达，提示聚肌胞联合E7(44-62)能够改善DC 的免疫功能，为启 动和维持的抗肿瘤免疫应答提供必要的条件。

宫颈癌患者全身免疫功能低下时，常表现为外周血中DC 功能、构成上的缺 陷，因此通过对外周血DC 免疫功能的检测能够评估患者的免疫状态。在前期工 作的基础上将研究对象从动物过渡到人，研究聚肌胞联合E7(44-62)对外周血DC 的免疫增强作用，为疫苗的临床应用提供理论和实验依据。