HTLV感染 白杨素对HIV1感染、复制和CD4+T细胞活化的抑制

白杨素对HIV1感染、复制和CD4+T细胞活化的抑制

【关键词】 白杨素 hiv  1 细胞融合 慢性免疫活化 流式细胞术 inhibitory effect of chrysin on hiv  1 and immune activation in vitro zhao ling  zhai, zeng yao  ying, zeng xiang  feng, lin chang  le, li hai  xian, huang xiu  yan, wang tong. institute of tissue transplantation and immunology, jinan university, guangzhou 510632, china ［abstract］ objective:to investigate the effects of chrysin(cr) on the infection and replication of hiv  1 ,and activation of cd4+ htl in response to pha in vitro.methods:the effect of chrysin on hiv  1 infection and replication in vitro were detected by cell fusion of mt  2 cells and hiv  1ⅲb/h9 cells labeled calcein  am and the inhibition study of syncytia formation and p24 production monitored in culture supernatant of mt  2 cells infected by hiv  1ⅲb, respectively. flurescence conjugated monoclonal antibodies and flow cytometry were used to detect the expression of cd69 by activated cd4+t in response to pha.results:the cr inhibit the cell fusion of h9/hiv  1ⅲb cell and mt  2 cell, the formation of syncytia and production of p24 was 7.24±0.43, 6.74±0.47 and 8.16±0.30. cr inhibited the expression of cd69 in activated cd4+t in response to pha in a concentration  dependent manner.conclusion:chrysin can inhibit the infection and replication of hiv  1 and activation of cd4+t in vitro. ［key words］ chrysin；
hiv  1；
cell fusion；
chronic immune activation；

flow cytometry艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome, aids）是由人免疫缺陷病 毒（human immunodeficiency virus, hiv）引起的一种致死性传染病，其流行范围 广，致死率高，严重威胁着人类生命安全。WWW.133229.cOMaids最主要特征是 cd4+t淋巴细胞渐进性丢失，最终导致感染者的免疫缺陷。研究表明，hiv介导的 普遍性免疫过度活化是导致cd4+t细胞不断丢失、推动aids发展的重要因素［1］。

在hiv感染过程中，病毒复制与免疫细胞活化相互联系、互为因果。病毒持续高 水平复制不断产生抗原，反复刺激t细胞，引发宿主普遍性免疫过度活化；
而活 化的cd4+t细胞对hiv又更加易感，增加了hiv的复制。因此，既能有效抑制病毒感 染和复制，又能抑制免疫活化的药物，在hiv感染/aids的临床治疗方面可能有一 定的应用前景。

白杨素（chrysin, cr），化学名为5，7  二羟基黄酮，是从紫薇科植物 木蝴蝶中提取的一种具有广泛药理作用的黄酮类化合物，在蜂胶和蜂蜜中含量较 高，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用［2  4］。我们研究发现cr对免疫系统有一 定的抑制作用，是一种潜在的免疫抑制剂（结果未显示）。因此，本文以cr作为 免疫活化抑制剂，探讨其对hiv  1感染和复制的影响，从而为其可能的临床应用 提供理论和实验依据。

1 材料与方法 1.1 药物和试剂 白杨素、四甲基偶氮唑盐（mtt）和植物血凝素 (phytohemagglutinin , pha)购自sigma；
叠氮胸苷（3′  azido  3′deoxythymidine, azt） 购自美国biochemika fluka；
钙黄绿素（calcein  am）购自molecular probe公司；

hiv  1p24抗原检测试剂盒购自zeptometrix公司；
anti  hcd69  fitc(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)和anti  hcd4  pe(phycoerythrin，藻红蛋白)和 anti  hcd3  apc(allophycayanin)为becton dickinson公司产品；
rpmi1640、胎牛血 清(fetal bovine serum, fbs)及β  巯基乙醇等细胞培养试剂购自gibco brl公司。

1.2 细胞和病毒 hiv  1ⅲb慢性感染的h9细胞（h9/hiv  1ⅲb）和 mt  2细胞由南方医科大学免疫教研室惠赠;c8166细胞由中国科学院昆明动物所 郑永唐教授惠赠；
外周血采自健康志愿者。

1.3 方法 1.3.1 实验毒株的制备 处于对数生长期的h9/hiv  1ⅲb细胞和c8166细胞以1∶1的细胞数目比混合培养。待80%以上细胞形成合胞体时，再加入3倍 数量的c8166细胞，继续培养3天，离心收集上清（4℃、7 000 g×15分钟），其上 清再次离心（4℃、17 000 g×1小时），病毒沉淀用rpmi1640培养基重悬，分装， -80℃冻存。

1.3.2 病毒滴度的测定 以tcid50为病毒定量指标。取1.3.1的病毒，以 rpmi1640培养基10倍倍比稀释(10-1～10-10)，每孔150 μl接种于96孔板，然后加 入终浓度为2×109 l-1的mt  2细胞悬液50 μl，同时设mt  2细胞空白对照。每样本 设6个复孔，37℃、5%co2孵箱中培养，第3天开始观察细胞病变(cpe)，直到cpe 不再形成。计算各稀释度病毒液出现cpe的孔数，按reed  muench法计算tcid50为 10-5.1。

1.3.3 cr对细胞的毒性实验 将浓度为1×109 l-1的mt  2细胞、1×108 l-1 的h9/hiv  1ⅲb细胞悬液按每孔100 μl分别接种于96孔板，然后加入2倍倍比稀释 的cr，每孔100 μl，设3个复孔，另设溶剂对照及mt  2细胞、h9/hiv  1ⅲb细胞空 白对照。37℃培养，第4天mtt法用酶标仪读取吸光度a490值，计算细胞生长抑制 率（%）＝(1-实验孔a值/对照孔a值)，按reed  muench法计算ic50［5］。

1.3.4 cr对h9/hiv  1ⅲb细胞与mt  2细胞融合的影响 用1 mmol/l的 calcein  am按每1×105细胞2.5 μl量标记h9/hiv  1ⅲb细胞，37℃孵育30分钟，pbs 离心洗涤2次。用含10%fbs的rpmi1640培养基重悬，调整细胞密度为2×108 l-1， 每孔50 μl接种于96孔板。然后加入50 μl倍比稀释的cr，同时设不加药物的细胞对 照，每样本设3个复孔，37℃培养30分钟。然后每孔加入密度为1×109 l-1 mt  2 细胞100 μl，37℃培养2小时。倒置荧光显微镜下对融合细胞进行计数(n)，每孔 随机计数4个视野，取均值［6］。计算抑制率（%）=（1-实验孔n值/对照孔n值）， 按reed  muench法计算ec50，并算出选择指数（si）。

1.3.5 cr对hiv  1诱导mt  2细胞形成合胞体的影响 将密度为2×109 l-1 mt  2细胞悬液每孔50 μl接种于96孔板，每孔滴加200 tcid50的hiv  1ⅲb 病毒 液50 μl，然后加入5倍倍比稀释的cr，每孔100 μl。同时设细胞空白对照、病毒对 照和azt（250 μg/l）对照各3个复孔，37℃、5%co2培养。第3天在倒置显微镜下 对hiv  1诱导形成的合胞体进行计数(n)，计算方法同1.3.4。

1.3.6 cr对hiv  1 p24抗原产生的影响 以1 000 tcid50 hiv  1ⅲb病毒攻 击mt  2细胞（细胞密度为1×109 l-1），细胞悬液与病毒容积比为1∶1，37℃孵 育2小时。离心，弃上清，pbs洗涤2次，用含10%fbs的rpmi1640培养基重悬，调整细胞密度为1×109 l-1。每孔100 μl细胞悬液加入96孔板，然后加入5倍倍比稀释 的cr，37℃、5%co2培养。3天后更换培养液，继续培养3天。收集上清用p24抗原 检测试剂盒测定hiv  1p24抗原。计算抑制率（%）=（1-实验孔a值/对照孔a值）， 同1.3.4算出ec50和si。

1.3.7 cr对pha刺激的人外周血cd4+t细胞cd69表达的影响 无菌条件下， 将人血液收集到加有肝素钠抗凝剂的试管内，以ficoll  urografin密度梯度离心法 制备pbmc，重悬于含10%fbs的rpmi1640培养液(含50 μmol/l β  巯基乙醇)，调整 细胞密度为6×109 l-1，96孔板每孔加100 μl，然后加入100 μl稀释好的cr，cr终浓 度为5、25和50 μmol/l，37℃、5%co2培养箱中温育2小时 。然后加入终浓度为 10 mg/l的pha培养20小时，分别收集各孔细胞，分别收集各孔细胞进行3色荧光标 记，加入anti  hcd69  fitc、anti  hcd4  pe和anti  hcd3  apc抗体，混匀后4℃避 光作用30分钟。pbs离心洗涤细胞1次，重悬于300 μl的pbs中，进行流式细胞仪检 测。全部数据经facscalibur流式细胞仪和cellquest软件获取。fitc为荧光1（fl1）， pe为荧光2（fl2），apc为荧光4（fl4），先在前散射（fsc）对侧散射（ssc）二维 散点图中划出淋巴细胞区r1，在fl4对ssc中划出cd3+细胞区r2，然后在fl2对ssc中 划出cd4+细胞区r3，再在fl2对fl1的散点图中划出cd4-cd69-、cd4-cd69+、cd4+cd69+ 和cd4+cd69- 4个象限，该散点图细胞群来自r1×r2×r3区的细胞，即cd4+t细胞，对 cd4+cd69+区和cd4+cd69-区细胞群进行荧光强度检测，用 cd4+cd69+/cd4+cd69++cd4+cd69-，即获得活化的cd4+t细胞占总的t细胞的比例。

每管样品检测10 000个细胞，获得的数据用cellquest软件分析。

1.4 统计学处理 数据以x±s表示，用spss 10.0统计软件进行分析，统 计作图用microsoft excel，统计方法用单因素方差分析，p0.05差异有统计学意义。

2 结果 2.1 cr的细胞毒性 cr对mt  2细胞和h9/hiv  1ⅲb细胞的生长抑制率， 见图1a。对mt  2细胞的ic50为（82.61±4.48）μmol/l；
对h9/hiv  1ⅲb细胞的ic50 为（82.08±2.68）μmol/l。

2.2 cr抑制h9/hiv  1ⅲb细胞与mt  2细胞融合的作用 倒置荧光显微 镜下calcein  am标记的h9/hiv  1ⅲb细胞较强的均匀绿色荧光，体积较小，见图 2a，与mt  2细胞共同培养2小时后，可发生细胞融合，融合细胞荧光强度稍弱于 未融合的h9/hiv  1ⅲb细胞，细胞体积较大且形状不规则，见图2b。由融合细胞 数目结果算出cr抑制两种细胞融合的ec50=（11.47±0.66）μmol/l，si=7.24±0.43。2.3 cr抑制hiv  1诱导的mt  2细胞形成合胞体和减少p24抗原产生的 作用 cr对hiv  1诱导的mt  2细胞形成合胞体和降低p24抗原产生的抑制率，见图 1b和图1c，其ec50分别为12.33±0.90 μmol/l和10.14±0.37 μmol/l，si分别为6.74±0.47 和8.16±0.30。50 μmol/l的cr对hiv  1ⅲb诱导mt  2细胞形成合胞体抑制率为 89.18%和250 μg/l的azt对照（抑制率为91.61%）相比没有显著差异（p＞0.05）， 对p24抗原产生的影响（抑制率分别为87.95%和94.38%）两者比较有显著差异 （p0.05）。

图1 cr对mt  2细胞和h9/hiv  1ⅲb细胞的毒性（a），对h9 / hiv  1ⅲ b细胞与mt  2细胞融合抑制作用（b），抑制hiv  1ⅲb诱导mt  2细胞形成合胞 体作用（c）和p24抗原产生的抑制作用（d）（略） fig.1 cytotoxicity of chrysin on mt  2 cell and hiv  1ⅲb cell(a), inhibitory effect of chrysin on the fusion of hiv  1ⅲb/h9 cell and mt  2 cell(b), hiv  1ⅲb induced syncitia formation inhibition(c) and p24 antigen in culture supernatants inhibition(d) 图2 倒置荧光显微镜下calcein  am标记的hiv  1ⅲb/h9细胞及其与 mt  2细胞发生融合的细胞(×400)（略） fig.2 h9/hiv  1ⅲb cell labeled by calcein  am and the fusion of h9/hiv  1ⅲb cell and mt  2 cell observed under reverted fluorescent microscope(×400) 图3 流式细胞术分析cr对人外周血cd4+t细胞cd69表达的影响（以其中 一次实验为例）（略） fig.3 the expression rate of cd69 on human cd4+t cells analysed by flow cytometric(take one of examples) note:a.control;b.pha;c.pha+cr(5 μmol/l);d.pha+cr(25 μmol/l);e.pha+cr(50 μmol/l). 2.4 cr对pha刺激的人外周血cd4+t细胞cd69表达的抑制效应 人外周血 cd4+t细胞在静息状态下cd69的表达率为1.52%±0.08%，经pha刺激20小时后cd69 的表达增加到70.58%±1.35%，加入cr（终浓度为5、25和50 μmol/l)后cd69表达的 百分率依次为63.66%±2.22%、50.34%±1.12%和33.74%±1.08%，见图3。cd69的表 达百分率各加药组与pha对照相比p0.05。

3 讨论hiv基因编码蛋白通过其抗原和超抗原作用反复刺激t细胞，引发宿主普 遍性的免疫过度活化，活化的cd4+ htl对hiv更加易感，加速了cd4+ htl的损耗，而 且还可以通过“旁观者”效应和活化诱导的细胞凋亡机制导致感染和非感染的细 胞死亡，进而发展成为aids［7］。目前临床治疗hiv感染/aids的最有效方法是高 效抗逆转录病毒治疗（highly active anti  retroviral therapy，haart）。haart使用两 种或三种逆转录酶抑制剂和至少一种蛋白酶抑制剂，主要作用于病毒生命周期的 两个不同阶段，可以使hiv感染者维持低血浆病毒载量，减少处于活化和增殖状 态的t淋巴细胞数目，部分重建免疫功能［8］；
有研究发现，haart与以t细胞为靶 向的经典免疫抑制剂环孢素a（cyclosporine a，csa）联合应用不但有助于降低病 毒载量，而且可以明显提高外周血cd4+ htl的数目。其原因就在于，csa能显著降 低细胞的过度活化状态，减少活化的cd4+ htl数目，从而减少hiv的感染和复制［9］。

遗憾的是，csa有较强的肾毒性而且haart还存在抗药性形成、对潜伏病毒不起作 用、费用高以及副作用大等问题，这都限制了其临床应用。因此，辅助治疗药物 的研发一直是hiv感染/aids临床治疗研究的热点之一。

黄酮类化合物（flavonoids compounds）是一类广泛存在于植物体内的低 分子多酚类物质，多以游离态或与糖结合成甙的形式存在，是许多药用植物的主 要活性成分。现已发现数百种不同类型的黄酮类化合物具有广泛的药理活性。大 量研究表明，该类化合物通过调节神经细胞、免疫细胞、心肌细胞、平滑肌细胞 的功能而发挥抗炎、抗过敏、抗氧化及抗癌等作用［10］。1989年，日本ono等 ［11］首次报道了黄芩素的抗hiv活性，此后，黄酮类化合物的抗hiv作用研究不 断取得进展，发现了很多具有抗hiv作用的天然化合物。白杨素（cr）是一种天然 的黄酮类化合物，本研究以pha刺激人外周血为研究活化模型，发现cr对cd4+ htl cd69（cd69又称aim或leu–23，是t细胞的早期活化标志分子之一，在静息的t细胞 上不表达）的表达有明显的抑制作用，而且该抑制效应呈剂量依赖性，提供了cr 抑制cd4+细胞活化的直接证据，证明了cr是一种有效的免疫活化抑制剂。而且我 们对其抗hiv  1活性研究发现，0.4 μmol/l时，对hiv的急性感染和病毒在细胞内 的复制都没有作用，当浓度增加到2 μmol/l时即有作用，随着药物浓度增加，作 用越来越强，最高实验浓度（50 μmol/l）时，对h9/hiv  1ⅲb细胞与mt  2细胞融 合抑制率接近90%，对hiv  1诱导的合胞体形成抑制作用与250 μg/l的azt（分子 量为267.25）对照相当，对hiv在胞内的复制也有较强的抑制作用。cr不仅对hiv  1的感染和复制有一定的抑制作用，而且能够有效地抑制 免疫活化，有研究发现cr可以竞争性结合酪蛋白激酶ⅱ（casein kinase ⅱ，ckⅱ） 的核苷酸结合位点，抑制ckⅱ的活性，从而抑制hiv的转录；
对潜伏感染的hiv也 有一定的抑制作用［12，13］。cr对hiv感染的多个位点发挥作用使其不容易产生 耐药性，而且具有多种生物活性，值得进一步探索。