【关于体外肝代谢系统的研究与应用探讨】肝代谢

关于体外肝代谢系统的研究与应用探讨

关键词：
细胞色素P450酶；
肝微粒体；
肝细胞培养；
肝组织切片；
离体 肝灌流 1肝微粒体 1.1肝微粒体的制备 多数采用差速离心法［2］，通过高速离心使微粒体与其他成分分离，操作 简单，无需其他试剂辅助。但较耗时，设备要求高，使该法的普及和深入研究受 到一定的限制。针对这些情况，可采用试剂辅助分离的方法［3］，在离心前额 外加入一定比例的PEG6000或CaCl2，促进微粒体沉降。此法对设备要求降低， 并缩短了实验周期。肝微粒体的制备过程均应在4 ℃下进行。正确、合理地选择 缓冲液，能起到良好介质的作用，按比例加入后进行肝组织的破碎和匀浆，才可 有效分离肝微粒体和避免细胞器受损。

1.2.1测定CYP450酶活性 1.2.2考察药物对肝药酶活性的影响 1.2.3进行药物体外代谢途径研究 将药物加入肝微粒体中进行孵育后，利用质谱检测离子碎片来鉴定代谢物的 结构，包括药物不同位点上的羟化物或去烷基产物，从而确定代谢途径。有报道 指出［8］，新型抗焦虑药AF  5加入人肝微粒体中进行孵育，经GC  MS分析， 鉴定出两种主要代谢产物：4  羟基  AF  5（Ⅰ）及4  羰基  AF  5（Ⅱ）。

AF  5在肝微粒体中代谢的主要产物为Ⅰ，Ⅰ在人肝微粒体中，可进一步转化为 Ⅱ，后者不再被代谢。周权等［9］把手性药物与大鼠肝微粒体相结合，对其立体选择性代谢作了 详细的考察。作者把R/S  普罗帕酮（propafenone，PPF）加入经地塞米松或β  萘黄酮诱导的大鼠肝微粒体中孵育，经提取及手性拆分后，进入HPLC系统分析。

结果显示，与对照组相比，在经诱导的肝微粒体中，PPF的Ⅰ相代谢呈显著的立 体选择性。

总之，改进后的体外肝微粒体法耗时少，重现性好，易大量操作。适用于酶 活性及体外代谢清除等方面的研究，在实际工作中应用较广。但同其他体外肝代 谢方法相比，需要的原材料较多，且与体内情况的一致性方面存在不足，因而其 结果是否有利预测体内情况仍需进一步研究。

2基因重组人肝微粒体CYP450酶系 基因重组CYP450酶系与前述的肝微粒体在研究药物代谢方面具有一定的相 关性。但前者在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法，并可在分 子水平上，为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息。尽管该方法 先进性较为突出，但由于受到设备条件和技术的限制，通过基因工程获得的酶量 与种类仍较有限，纯化程度有待进一步提高，故其作为研究代谢的体外系统的地 位仍有待进一步提高。

3肝细胞培养 3.1体外培养技术与细胞活性的维持 体外培养包括肝细胞株的培养和原代肝细胞的分离与培养。根据细胞来源于 不同，经重复筛选可制备出不同型号的肝细胞株，满足各种实验需要。肝细胞株 容易贴壁存活，在相对稳定的培养条件下，传20～30代不会出现明显衰老现象。

原代细胞需经过从器官中分离的过程，存在分离难度大、体外培养要求条件高、 存活时间短、增殖及传代困难等问题。多数研究者采用改良的Seglen两步胶原酶 灌注法。但此法操作繁琐，设备及实验技术要求高，影响因素较多［14］，包括 灌注液的种类和速度、肝脏灌洗是否充分、分离消化的酶、培养液的组成和肝细胞悬液的离心清洗等。鉴于上述原因，刘友平［15］等采用肝组织块贴壁法原代 培养，即只把组织块剪碎，不用胶原酶消化，直接按肝细胞的培养方法进行贴壁 培养，在传代时加胰酶消化，只取上层细胞悬液继续培养。该法简单快捷，无需 灌注、离心，所得肝细胞活力高。

为了解决肝细胞活性体外维持时间短的问题， Hengstler［16］等研究优化 肝细胞冷冻技术。同新鲜肝细胞相比，经过该技术冷冻储藏的肝细胞活性为新鲜 肝细胞的80%以上，而其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的活性60%，可用于反应时间不超过 8h的代谢研究，亦可用于药酶的诱导研究，但该技术仍需进一步优化。

3.2肝细胞培养的主要应用 3.2.1进行药物体外代谢途径与体内相关性研究 3.2.2进行药物体外代谢清除研究 Shibata［19］等人运用冷藏保存的人肝细胞混悬于100%的人血浆中，将预 测的肝利用度及清除率与14种临床常用的药物的生物利用度和血浆清除率进行 比较时，发现不同的细胞来源，内在清除率存在极大的个体差异性。同时在基础 的生物定标系数（3.1×109 个/kg）下，用外推法将体外实验结果应用于体内实验 的预测，往往会出现明显的偏低现象，因此计算的定标系数应比基础生物大3～5 倍。为获得更可靠的定量预测结果，通过预试验来确定校正的定标系数是至关重 要的环节。

由于在新鲜分离的肝细胞中，介导药物代谢的CYP450酶系存在时间依赖性 衰减的现象，所以一般的肝细胞培养都要求在肝细胞生存时间跨度内进行。

Griffin和Houston ［20］对体外单层肝细胞培养的内在清除能力（CLint）与新鲜 游离肝细胞悬液的清除能力进行比较，发现其内在的清除能力与代谢速度有关， 单层肝细胞体外实验更适合于代谢速度慢的药物。

总之，用肝细胞培养方法作为评价药物代谢的体外系统，存在一定的偏差。其结果与体内的情况相近程度，很大程度上取决于研究者的经验。

3.2.3参与新型多器官共培养的研究 在很长一段时间内，研究者都只是单纯考察药物代谢在某一种器官（如肝脏） 中的作用情况。而实际上，药物在体内的过程是多因素综合作用的。根据最新报 道［21］， 肝细胞参与整体非连续性多器官共培养体系（IdMOC），即把肝细 胞和来自于其他多个器官的非肝原代细胞一起培养，为在药物代谢和毒副效应方 面评价多器官之间的相互作用提供可能性。

肝细胞同肝微粒体相比，在代谢物生成、体外代谢清除等研究方面有许多相 似性，但针对代谢物种类、主要代谢物及所反映的代谢特性上存在着质或量的差 异。随着肝细胞冷冻技术的发展，因其体外活性维持时间短而造成的应用限制会 不断得到改善。

4肝组织切片 在各种器 [1]