[辣椒素对非小细胞肺癌侵袭能力影响及其机制讨论] 侵袭性肺癌

辣椒素对非小细胞肺癌侵袭能力影响及其机制讨论

虽然辣椒素具有抗癌症作用，但是其有关于NSCLC 的研究鲜见报导。本研究采 用人大细胞肺癌NCI-H460 细胞，旨在观察辣椒素对NCIH460细胞侵袭能力及E 钙黏蛋白( E-cadherin) ，Slug 蛋白表达的影响，为明确辣椒素治疗恶性肿瘤提 供实验依据，探讨其可能作用机制，以期为NSCLC 治疗提供新思路。

1 材料 1. 1 细胞人大细胞肺癌细胞NCI-H460，购自中科院上海细胞库。

1. 2 药物及试剂辣椒素( 纯度 99%) ，MTT，罗丹明标记的鬼笔环肽( 美 国Sigma 公司，批号分别为100081-201408，M2128，PHDR1) ，Transwell 小室 ( 美国Corning 公司，批号3140908 ) ，E-cadherin 蛋白，Slug 蛋白，-actin( 上 海浩然生物技术有限公司，批号分别为著名ZM0092，ZM2356，1208) ，E-cadherin 鼠抗人单克隆抗体( 美国Pro Mab 公司，批号70796267A2) ，Slug 兔抗人多克 隆抗体( 美国SantaCruz 公司，批号B2206) ，HRP 标记抗鼠IgG 二抗及HRP 标 记抗兔IgG 二抗( 上海碧云天公司，批号BSE-0140G，BSE-0520G) ，逆转录试 剂盒( 日本Promega 公司，批号9035-81-8) ，Quant SYBR GreenPCR 试剂盒( 美 国TaKaRa 公司，批号BS-PCR003) 。

1. 3 仪器DFC 450C 型倒置显微镜( 德国莱卡公司) ，ABI-7300 型PCR 仪( 美国ABI 公司) 。

2 方法 2. 1 细胞培养NCI-H460 细胞保存在含有10%BSA 的RPMI-1640 营养培养基( 含L-谷氨酰胺，青霉素100 UmL - 1 和链霉素100 UmL - 1 ) ，37 ℃， 5%CO2及饱和湿度下培养。当NCI-H460 细胞达80%汇合度时，用0. 05%胰蛋白 酶/0. 02% EDTA 消化。按照细胞密度2 106 个/孔接种于超低吸附6孔板中， 37 ℃，5 %CO2及饱和湿度下培养48 h。收集悬浮的细胞经EDTA 处理制备成单 细胞悬液，然后用RPMI-1640 培养液洗涤细胞。收集对数生长期细胞，备用。

2. 2 药物配置辣椒素溶解于DMSO，配成500 mmolL - 1溶液，- 20 ℃ 保 存。临用时，以完全培养液将辣椒素稀释到所需浓度。

2. 3 MTT 比色分析法测定细胞抑制率取对数生长期NCI-H460 细胞，按 照细胞密度1 104 个/孔接种于96 孔板中，总体积为200 L，过夜培养。次日，实 验组每孔加入终浓度为0， 100， 200， 300，400，500 molL - 1的辣椒素，空 白组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。每组设6 个平行孔，将培养 板置于37 ℃ 5% CO2及饱和湿度下培养，分别培养24， 48 h 后，每孔加入MTT 溶液( 5 gL - 1 ) 20L， 37 ℃，继续培养4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清 液，然后每孔加入DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，570 nm 波长处， 以空白培养液调零点，酶标仪测定吸光度A，取6 孔平均值。在graphpad prism 5 统计软件中计算出半数抑制浓度( IC50) 。抑制率= ( A实验组- A空白组) /( A空白 组- A对照组) 100%。

2. 4 微丝荧光染色观察根据江隆昌和欧阳理权等方法，取对数生长期 NCI-H460 细胞，按照细胞密度2 103 个细胞/接种于96 孔板中，实验组每孔加 入终浓度为100， 200， 300 molL - 1 的辣椒素各10L，空白组除未加辣椒素外， 其余条件与实验组完全一致。每组设6 个平行孔。PBS 洗涤2 次，再用4%多聚 甲醛溶液于37 ℃固定10 min;
然后，用含0. 1%TritonX-100 的PBS 洗涤细胞3 次，每次4 min。用含0. 2%BSA 的PBS 封闭30 min。随后，将细胞与1∶ 100罗 丹明标记的鬼笔环肽PBS 孵育15 min，PBS 洗涤3次。Olympus IX51 型荧光显 微镜496 nm 处，观察细胞微丝的形态学变化。实验重复3 次。

2. 5 Transwell 小室体外侵袭实验根据史立宏等方法，Transwell 小室用前 铺上0. 5% Matrigel膜基质50 L 于37 ℃孵育过夜4 h。取对数生长期NCI-H460 细 胞，将实验组细胞用终浓度为100，200，300 molL - 1 的辣椒素， 37 ℃ 5% CO2 及饱和湿度下培养24 h，空白组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。

按照5 104 个细胞接种于Transwell 小室内室，并在Transwell 小室下室加入含有 10% BSA 的完全培养液。孵育24 h 后，取出Transwell 小室去除未穿膜细胞。

甲醇固定15 min 后，再以10 gL - 1 Hoechst33342 染色30 min。OlympusIX51 荧光显微镜计数穿过微孔膜的细胞数。每组细胞随机计数10 个视野，取其平均值。

实验重复3 次。

2. 6 Western blot 分析取对数生长期NCI-H460 细胞，将实验组细胞用终 浓度为100， 200， 300 molL - 1的辣椒素， 37 ℃ 5%CO2及饱和湿度下培养24 h，空白组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。用细胞裂解液( 20 mmolL - 1 Tris-HCl， 1. 5%Triton X-100，150 mmolL - 1 NaCl，10% 甘油，1 mmolL - 1Na4P2O7，50 mmolL - 1 NaF，1 mmolL - 1 PMSF) 和蛋白酶抑制剂( 5 molL - 1 AEBSF-HCl，5 molL - 1EDTA，10 mmolL - 1 leupeptin，1. 5 mmolL - 1 E-64，pH 7. 4) 裂解细胞后，收集裂解液，Bradford 法测定蛋白质含量。取20 g 蛋 白质加入等体积2 上样缓冲液，95 ℃ 变性5 min。随后进行7. 5% SDSPAGE凝 胶电泳。电泳后，电转至0. 45 m 硝酸纤维素膜，用含5% 的脱脂奶粉PBST( 25 mmolL - 1Tris pH 7. 5， 150 mmolL - 1 NaCl，0. 1% Tween20) 封闭1 h，分别加 入E-cadherin 抗体，Slug 抗体( 1∶ 1 000稀释) 4 ℃孵育过夜，PBST 洗涤3 次， 每次5 min。加入HRP 标记的二抗( 1∶ 2 000 稀释) 室温孵育2 h，PBST 洗涤3 次，每次5 min。按同样的方法与-actin 抗体孵育。ECL 化学发光试剂显色，通 过Bio-Rad 凝胶成像进行目的条带的表达检测及分析。蛋白的相对表达强度= 目 标蛋白表达强度/-actin蛋白表达强度。

2. 7 Real-Time PCR( RT-PCR) 分析取对数生长期NCI-H460 细胞，将实验 组细胞用终浓度为100，200， 300 molL - 1 的辣椒素， 37 ℃ 5% CO2及饱和 湿度下培养24 h，空白组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。按照 TRIzol 试剂盒说明书抽提总RNA。Nanodrop2000 检测RNA 纯度。使用MMLV 逆转录试剂盒进行逆转录反应，成单链的cDNA，操作按照试剂盒说明书进行。

利用Pubmed查找相关基因序列，并利用引物合成软件PrimerPremier 5. 0 设计引 物，引物序列见表1。使用QuantSYBR Green PCR 试剂盒按照PCR 引物进行扩 增，用Applied Biosystems 7500 型定量PCR 仪测出Ct值及熔解曲线，计算出相 对基因表达量。每份样品检测3 次。

2. 8 统计学分析采用SPSS 17. 0 软件进行数据分析，计量数据用珋x s 表 示，正态资料组间比较采用t 检验，多样本均数采用单因素方差分析，以P 0. 05 为 差异有统计学意义。

3 结果 3. 1 对NCI-H460 细胞增殖的影响不同终浓度( 100 ～ 500 molL - 1 ) 的辣椒素分别作用于NCIH460细胞24，48 h 后，随着终浓度的增大和作用时间的 延长，其对细胞的抑制率也明显增强，呈浓度和时间依赖性，与空白组比较，差 异具有统计学意义( P 0. 05) 。辣椒素24， 48 h 的IC50分别为366. 2，328. 2 molL - 1。

3. 2 对NCI-H460 细胞丝状伪足形成的影响微丝荧光染色后发现，辣椒素 终浓度为100 molL - 1时，NCI-H460 细胞有明显的丝状伪足形成，表现为细胞表 面形成微丝突起并且延伸到细胞外，而且充满与相邻的其他肿瘤细胞相接触的平 行排列肌丝纤维。辣椒素终浓度为200， 300 molL - 1 时，NCI-H460 细胞未见 明显丝状伪足形成，可有效抑制丝状伪足的伸出，仅见细胞表面可见少量突起， 肌动蛋白丝网状排列。

3. 3 对NCI-H460 细胞体外侵袭能力的影响辣椒素终浓度为200，300 molL - 1时，NCI-H460 细胞侵袭细胞数均显著下降，并呈浓度依赖性，与空白 组比较，差异具有统计学意义( P 0. 05) 。辣椒素终浓度为100 molL - 1时， NCI-H460 细胞侵袭细胞数虽然减少，但是与空白组比较，差异无统计学意义。

3. 4 对NCI-H460 细胞E-cadherin，Slug 蛋白表达的影响辣椒素终浓度为 200， 300 molL - 1 时，显著升高E-cadherin 表达水平，并呈浓度依赖性，与空 白组比较，差异具有统计学意义( P 0. 05) 。辣椒素终浓度为200， 300 molL - 1 时， 显著降低Slug 表达水平，并呈浓度依赖性，与空白组比较，差异具有统计学意 义( P 0. 05，P 0. 01) 。辣椒素终浓度为100 molL - 1 时，E-cadherin 和Slug 表达 水平与空白组比较，差异无统计学意义。

3. 5 对NCI-H460 细胞E-cadherin，Slug mRNA 表达的影响辣椒素终浓度 为200， 300 molL - 1 时，显著升高E-cadherin mRNA 表达水平，并呈浓度依赖 性，与空白组比较，差异具有统计学意义( P 0. 05) 。辣椒素终浓度为200，300 molL - 1 时，显著降低Slug mRNA 表达水平，并呈浓度依赖性，与空白组比较， 差异具有统计学意义( P 0. 05，P 0. 01 ) 。辣椒素终浓度为100 molL - 1 时， Ecadherin和Slug mRNA 表达水平与空白组比较，差异无统计学意义。

4 讨论 肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，其中80%为NSCLC，只有20% ～ 30% 的患者有手术机会，但是即使是在手术切除的早期NSCLC 患者中，也有2 /3 的患者存在复发和转移的危险，侵袭转移是患者死亡和治疗效果不理想的主要原因。目前对于放疗、化疗等主要治疗肺癌的手段已经进入平台期，然而其分子机 制尚不明了，因此探讨肺癌分子水平侵袭转移机制尤为必要。

近年来，传统中药应用于抗癌症的治疗成为研究抗癌药物的新的热点，受 到广大医药学工作者的广泛重视。辣椒素( 结构为反式8-甲基-N-香草基-丁-壬烯 胺) 是红辣椒中的一种活性成分，作为食物和传统药物已有几千年的历史，于 1999 年载入《美国药典》。辣椒素可通过多种途径在体内外发挥抗癌症作用， 如刘南等研究表明，辣椒素可抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤得生长。另外还有报道 称，辣椒素可诱导人黑色素瘤A375-S2 细胞的凋亡。然而辣椒素对NSCLC 是否 具有抑制作用目前尚不明了。故此，本研究以不同终浓度辣椒素作用于NCI-H460 细胞，观察辣椒素的抗NSCLC 效应。结果发现辣椒素对NCI-H460 细胞细胞活 率有一定抑制作用，提示辣椒素具有潜在的抗NSCLC 效应。E-cadherin 是一类 主要介导细胞之间相互黏附的钙依赖性跨膜蛋白，主要表达在上皮细胞，广泛参 与细胞间的连接，对于维持正常上皮细胞的完整性十分重要。E-cadherin 结构和 功能异常可致癌细胞间黏附松散，癌细胞极易从原发部位脱落，并沿淋巴管，血 管外膜及组织间隙浸润蔓延，破坏邻近正常组织并继续生长，形成转移癌。Slug 基因是Snail超家族成员之一，能识别E-cadherin 基因启动子上E2-box 元件以抑 制靶基因E-cadherin 的转录，下调E-cadherin 蛋白表达，共同促进癌症细胞的原 位侵袭和远处转移。赵志娟等研究表明，Slug 基因的过表达同时伴有E-cadherin 的低表达或缺失与诱发胰腺癌、骨肉瘤、结直肠癌、口腔鳞癌等肿瘤的发生、发 展和转移高度相关。本研究中，以辣椒素处理NCI-H460 细胞，微丝荧光染色和 Transwell 小室体外侵袭实验结果显示，辣椒素可显著抑制丝状伪足形成和侵袭 细胞数，证明辣椒素可抑制癌症细胞的侵袭。进一步通过Western blot 和RT-PCR 分析结果显示，辣椒素可减少NCI-H460 细胞Slug 蛋白和mRNA 表达，增加 E-cadherin 蛋白和mRNA 的表达，揭示辣椒素可能通过抑制Slug 表达而增加 Ecadherin表达来抑制癌症的远处侵袭能力。本研究结果与赵志娟等研究结果高度 类似，故此可以推测，抑制Slug 表达和增加E-cadherin 表达可抑制NSCLC 侵袭。

综上所述，辣椒素具有明显的NCI-H460 细胞毒性作用，可降低NCI-H460 细胞活率。而且辣椒素可通过降低Slug 表达，增加E-cadherin 表达抑制NCI-H460 细胞侵袭能力，可能是其抗NSCLC 的机制之一，为NSCLC 治疗提供新的思路。