【开口箭皂苷体外抗肿瘤作用的初步实验研究】开口箭怎么喝才安全

开口箭皂苷体外抗肿瘤作用的初步实验研究

【关键词】 开口箭；

皂苷；

mtt法；

流式细胞仪 开口箭tupistra chinensis bak.系百合科liliaceae铃兰族开口箭属植物， 为著名的传统中药。Www.133229.COm医学古籍记载，开口箭味甘微苦，性寒， 主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调、崩漏带下等症；
其中中医认为 月经不调、崩漏带下即是现代宫颈癌的常见症状。初步实验表明开口箭具有祛痰、 抗炎、抑菌及醒酒作用［1，2］。

本实验室通过实验显示湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元,且 含量较高［3］。有关研究结果表明，皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿 瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性,近年越来越受人们的普遍关注。有 研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性［4，5］。本文旨在通过体外抗 肿瘤实验,观察开口箭皂苷对宫颈癌细胞hela细胞和肝癌细胞hepg2细胞的细胞毒 活性,并通过流式细胞仪评价开口箭活性部位对hela细胞细胞周期的影响和诱导 该肿瘤细胞凋亡情况。现报道如下。

1 材料与仪器 1.1 细胞株人宫颈癌细胞（hela）、人肝癌细胞(hepg2)均由三峡大学分子生物学研究所提供。

1.2 药品与仪器rpmi-1640为美国gibco公司产品；
新生小牛血清为杭 州四季青生物材料有限公司产品；
hepes为美国sigma公司产品；
胰蛋白酶为美国 gibco公司产品；
四氮唑蓝(mtt)为美国amresco公司产品；
环磷酰胺 (cp,江苏恒瑞 医药股份有限公司，批号：07020121)。酶联免疫检测仪(genios tecan)；
co2培养 箱（日本三洋公司）；
ld4-2a离心机(北京医用离心机厂)；
96孔板(美国cornning 公司)。

开口箭根茎于2002-07采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命 科学学院陈发菊副教授鉴定为tupistra chinensis bak.，标本存放于湖北省天然产物 研究与利用重点实验室（no.tc200207snj）。

2 方法 2.1 药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取，合并提取液，浓 缩后经氯仿脱脂后用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后 即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、 95%乙醇梯度洗脱，得开口箭4部分皂苷。

分别取开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷两个样品，用 pbs配制成所需浓度，依次为312.5，625，1 250，2 500，5 000，10 000 μg/ml， 70% 开口箭皂苷用pbs配制成所需浓度，依次为156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/ml，所有受试样品均用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。环磷酰胺 (cp)用dmso 将其配置为500 mg/ml。

2.2 细胞培养 hela和hepg2细胞用rpmi-1640培养液（另加10mmol/l hepes、2.0 mg/mlnahco3、100 u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%新生小牛血清）， 于co2孵箱中37℃，5%co2饱和湿度下培养。贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。

2.3 开口箭活性部位对hela和hepg2细胞杀伤作用最佳实验条件的选 择mtt法实验条件的初步优化，主要是对溶解药物的溶剂（水、pbs）、加药前的 培养时间（6，12，24 h）、药物剂量和细胞密度进行了摸索。其中密度细胞分 别取0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml,接种于96孔培养板,每孔接种100 μl， 转板24 h后加不同浓度的开口箭活性部位，继续培养48 h，以mtt法测定吸光度，比较不同细胞密度的线性关系。

2.4 mtt比色法［6］mtt比色法按mosmann氏法略加改进。将处于对数 生长期的细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为0.5×105个/ml,接种于96孔培养板, 每孔接种100 μl，转板24 h后加100 μl受试药,另设阴性对照组(不加药)、空白调零 组（只有pbs）和阳性对照组（环磷酰胺组），每组均设3个复孔，培养48 h，吸 弃上清后加mtt(5 mg/ml)100 μl,继续培养4 h后,弃去上清液，加dmso 100 μl,用全自 动酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定吸光度(od)值［7］,求出ic50。

抑制率（%）=［阴性对照a570- 加药组a570］/ 阴性对照a570×100% 2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分1×106个细胞于培养瓶， 阴性对照组0.5×106个细胞每瓶，培养24 h；
吸弃部分上清后加药混匀（开口箭总 皂苷、30%皂苷终浓度2 500μg/ml，70%皂苷和环磷酰胺终浓度1 250 μg/ml）， 继续培养48 h；
于5%co2培养箱中培养48 h后，收集上清于相应标签离心管中， 各加1 ml胰酶消化，加4 ml培养液于该培养瓶中，并一起吸至各相应离心管中， 各瓶加入5 ml pbs洗涤，洗涤液一起吸入相应离心管中，以2 000 r/min离心5 min；

吸弃上清，加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/ledta(na)2的pbs混合液悬起细胞，轻轻 混匀，于4℃固定30 min；
弃上清，加pbs 10 ml混匀，以2 000 r/min离心5 min；

用500 μl含0.1%tritonx-100 和50 μg/ml rnase的pbs悬起细胞，转置测定管中，加溴 化丙锭pi 100 μl，避光染色17 min（一般15～20 min）；
滤膜过滤后上机。

2.6 统计学处理 实验数据以 ±s表示，数据分析采用spss10.0统计软件 进行。用origin软件，通过半对数拟合直线求ic50值。

3 结果 3.1 开口箭活性部位对hela和hepg2细胞杀伤作用最佳实验条件的选 择为了得到相对稳定并且可靠的实验结果，通过前期预实验并结合大量资料，对 该mtt法实验条件进行了初步优化，主要是对溶解药物的溶剂、加药前的培养时 间、药物剂量和细胞密度进行了探索。对于溶剂，最初采用的溶剂是水，通过对 照发现溶解药物的水对细胞的影响很小，但并非没有，所以正式实验采用pbs溶 解药物；
对于加药前的培养时间采用了6，12，24 h 3个时间，通过显微镜观察发 现加药前培养24 h细胞状态良好，由此选用了加药前培养24 h；
对于药物剂量， 通过多次预实验，最终选择了最高浓度开口箭总皂苷、30%皂苷为10 000 μg/ml，70%皂苷为5 000 μg/ml，而环磷酰胺为20 000 μg/ml；
对于细胞密度，通过多次预 实验，采用5种细胞密度即0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml，同样的药 物浓度情况下，开口箭活性部位对hela细胞生长抑制呈最好线性关系的细胞密度 是0.5×105 个/ ml，由此选择最佳细胞浓度是0.5×105个/ml。通过这些因素的优化， 从而初步排除了其他非药物因素对细胞的影响；
而且这两种肿瘤细胞的mtt实验 在同一批进行实验，排除了不同环境的干扰，从而得出以下实验结果。

3.2 开口箭活性部位对hela细胞的影响结果见表1。表1 开口箭皂苷对 hela细胞的抑制作用（略） 由表1可以看出，和阳性药环磷酰胺相比，开口箭总皂苷、30%皂苷、 70%皂苷对hela细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有非常显著性差异 （p0.005），且呈良好的量-效关系,开口箭70%皂苷的抑制作用强于总皂苷、30% 皂苷。

3.3 开口箭活性部位对hela细胞流式细胞术分析结果见图1及表2。表2 开口箭皂苷对hela细胞流式细胞仪分析数据（略） 从该原始图谱可以看出，阴性对照组hela细胞细胞状态良好，由于药物 浓度较高，尤其是开口箭总皂苷、70%皂苷中的凋亡峰急剧上升，这说明高浓度 开口箭总皂苷、70%皂苷可以诱导肿瘤细胞坏死。

从表2可以看出， 2 500 μg/ml开口箭总皂苷、30%皂苷，1 250 μg/ml 70% 皂苷和环磷酰胺作用于hela细胞，通过和阴性对照组比较，开口箭总提取物、总 皂苷、30%皂苷、70%皂苷、环磷酰胺主要使hela细胞细胞周期阻滞于s期并能诱 导肿瘤细胞凋亡。

3.4 开口箭活性部位对hepg2细胞的影响 结果见表3。表3 开口箭皂 苷对hepg2细胞的抑制作用（略） 由表3可以看出，和阳性药环磷酰胺相比，开口箭总皂苷、30%皂苷、 70%皂苷对hepg2细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有非常显著性差异 （p0.005），且呈良好的量效关系,其中开口箭70%皂苷的抑制作用强于总皂苷、 30%皂苷。

4 讨论mtt法是目前抗癌药物体外筛选较好的方法，方法简便、快速，所需细 胞数较少，便于大规模进行药物敏感实验。本实验采用mtt法评价开口箭活性部 位的细胞毒作用，四甲基偶氮唑盐（mtt）法与其它初筛方法如台盼蓝计数法相 比具有主观性低，简便易行等优点，因此被广泛用于抗肿瘤药物的初筛。在优化 的实验条件下，采用环磷酰胺做阳性对照，通过对人肝癌细胞hepg2和宫颈癌细 胞hela细胞的mtt实验，结果显示开口箭总皂苷、30%皂苷和70%皂苷能够使显著 抑制体外培养的hela和hepg2细胞株，与阴性对照组比两者各浓度组均有非常显著 性差异（p0.005），且在此浓度范围内细胞毒作用呈现较明显的剂量依赖性；
进 一步通过比较两者的半数有效浓度，得出开口箭皂苷对肝癌细胞hepg2较为敏感， 即开口箭皂苷抗肿瘤具有一定的选择性。

采用流式细胞术评价开口箭活性部位对hela细胞细胞周期的影响和凋 亡情况，最初采用的是70%乙醇固定过夜，但实验发现该方法容易使细胞成团， 而且测出的凋亡峰比较高，由此改进为本实验中的实验方法，细胞成团的情况得 到改善，但是凋亡峰明显降低。结果表明，开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷 和环磷酰胺能够诱导体外培养的hela细胞凋亡，且高剂量的开口箭总皂苷、70% 皂苷能够引起细胞坏死；
开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷和环磷酰胺都能使 hela细胞细胞周期阻滞于s期，提示开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷能诱导人 宫颈癌细胞分化。

从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物 研究的重要组成部分。国际上普遍认为最理想的抗癌药物是那些通过刺激机体自 身免疫系统而发挥正常防癌功能的药物。目前应用于临床的抗肿瘤化疗药物多数 对机体免疫能力起抑制和破坏作用，在杀灭机体内癌细胞的同时也损伤机体正常 组织，副作用大［8］。大量临床和实验资料显示，皂苷具有免疫调节作用。另 据文献报道开口箭对s180和hepg2肿瘤细胞株有明显的抑制作用［9］；
本实验发 现开口箭皂苷对hela和hepg2细胞有较强的细胞毒作用，而且开口箭皂苷能够诱导 hela细胞凋亡，且能够将hela细胞细胞周期阻滞于s期从而诱导hela细胞分化。因 此对开口箭皂苷的抗肿瘤作用及机制值得进一步研究。