什么是遗传学诊断【对遗传学诊断的分析】

对遗传学诊断的分析

一、运用单细胞双重巢式PCR和MDA技术方法行性连锁遗传病诊断 方法1、提取男女单个淋巴细胞各150例，共300个细胞。随机分成3 组，每组男女细胞各50个，双重巢式PCR技术在单细胞水平同时扩增 X-类固醇 硫酸脂酶基因(steroid sulfatase gene， STS)/Y-假基因和牙釉质基因(Amelogenin， AMEL)，对照组用单重巢式PCR技术在单细胞水平分别扩增两基因，比较单、双 重巢式PCR 技术在单细胞水平的扩增率及性别诊断正确率。2、应用MDA扩增5 个单个淋巴细胞和10个单个卵裂球全基因组DNA，1%的琼脂糖电泳检测扩增效 率，通过普通PCR即上述巢式PCR的第二轮的PCR条件检测细胞性别来判断扩增 产物的均一性。结果1、单重巢式PCR扩增男性细胞STS和AMEL的扩增率和细胞 性别诊断的正确率分别是84%、76%和84%、84%;而双重巢式PCR技术同时扩增 上述基因的扩增率和性别诊断正确率分别为98%、96%。后者与前两者相比扩增 率和性别诊断正确率均明显提高，差异均有统计学意义(P0.05、P0.01)。2、MDA 扩增5个淋巴细胞(3个为男性细胞，2个为女性细胞)全部扩增成功，扩增率 100%;MDA扩增10个卵裂球有4个扩出产物，扩增率为40%。以MDA产物为模板， 用STS的第二轮引物检测单个淋巴细胞性别，正确性为100%;检测所有扩出产物 的卵裂球也均能检测出性别，发现2个为男性，2个为女性，可惜的是这4个卵裂 球均来自不同的胚胎，所以不能相互验证。从淋巴细胞MDA产物检测的结果可 以判断MDA产物也是均一的。结论1、在单细胞水平性连锁遗传疾病诊断中，双 重巢式PCR技术较单重巢式PCR技术具有较高的扩增率及诊断正确率，并有助于 发现等位基因脱扣(allele dropout， ADO)。该法在无创性单基因伴性遗传病的产 前诊断和植入前遗传学诊断中具有较高的实际应用价值，且经济、便捷，值得临 床进一步推广。2、初步预实验可知 MDA可以克服单细胞的模板量少和不可重 复实验的缺点。但由于此次预实验的样本量太小，其稳定性、可靠性还需进一步 摸索，才可以用于单基因病的着床前遗传学诊断和产前诊断。

二、利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA进行无创性地中海贫血产前基因诊断的研究 方法：收集157例孕妇的外周血，利用柱吸收的方法提取血浆中的 cffDNA，经琼脂糖凝胶电泳分离富集小片段cffDNA，使用二重PCR 反应 (dulex-PCR)检测SRY基因和磷酸甘油醛脱氢酶(glycerol-dehyde- phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因。结果来源于86例孕男胎的孕妇血浆标本 的小片段cffDNA均检出SRY和GAPDH 基因，来源于71例孕女胎的孕妇血浆标 本的小片段cffDNA只检出GAPDH基因。与绒毛/羊水标本检测结果以及产后随访 结果相符。特异性和敏感性分别为100%(157/157)和100%(86/86)。结论利用琼脂 糖凝胶电泳，切胶回收，可以选择性富集孕妇外周血中的小片段cffDNA，相对 地提高胎儿DNA的含量，结合二重PCR扩增SRY基因技术可用于无创性产前性连 锁遗传疾病和单基因突变疾病的产前诊断。第二部分利用孕妇外周血浆中 cffDNA进行STR-PCR检测胎儿基因型目的：利用小片段cffDNA进行D5S818、 D7S820、D13S317三个短串联重复序列(short tandem repeat，STR)基因型的分析， 观察提取出来的小片段cffDNA中母源性DNA背景对实验的影响。方法：收集了 62例孕妇外周血标本，提取小片段游离胎儿DNA，利用多重PCR(mutilplex-PCR) 的方法分析胎儿的STR基因型，并与父母基因型相比对。结果：62例小片段cffDNA 的扩增结果中，49例标本的扩增结果完全与父母基因型相匹配，未发现母源性 DNA的污染。其余13例在D13S317基因座的扩增中出现了母源性DNA的污染。结 论：经过对小片段cffDNA进行富集后，仍有可能出现母源性DNA对实验的影响， 并且可能影响对实验结果的判读。使用多重PCR反应结合多基因座的扩增，可能 可以有助于减少母源性DNA的影响，有助于结果的判读。第三部分利用孕妇外 周血浆中小片段游离胎儿DNA进行β-地中海贫血无创性产前基因诊断目的：利用 cffDNA对胎儿进行广西、广东地区常见的17种β-地中海贫血基因型的检测，与 传统创伤性产前诊断相比较，探讨该方法的准确性和可行性。方法：针对广西、 广东地区常见的β-地中海贫血突变的基因型设计三对不同引物，并用生物素标记。

对cffDNA进行二次PCR反应后，使用反向斑点杂交(revert dot-blot hybridization， RDB)检测胎儿的β-珠蛋白基因型，与创伤性产前诊断结果比较，观察准确率。

结果：37例cffDNA标本检测中，检出重型β-地中海贫血19例，轻型β-地中海贫血 11例，正常7例，与创伤性产前诊断结果相比较出现3例误诊，准确率为 91.9%(34/37)。结论：利用 cffDNA进行β-地中海贫血的检测，可能出现母源性 DNA背景的污染，当胎儿基因型与母亲基因型相同时，必须提高警惕，进一步 分析或者复查。因为该技术取样容易，对孕妇胎儿无风险，不受孕期时间影响， 易为与孕妇接受，因此进一步改进该技术后有望可用于β-地中海贫血的诊断。第 四部分利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA进行巴氏水肿胎儿检测目的：通过检测cffDNA以及母源性cfDNA在PCR反应中扩增效率的不同，进行检测巴氏 水肿胎儿(Hb Bart’s hydrops foetus)的方法学研究。方法：对来源于拟诊孕水肿胎 儿孕妇的小片段cffDNA，进行荧光PCR(Fluorescence PCR)扩增，利用毛细管电 泳(capillary electrophoresis，CE)技术判断两种产物峰面积比(peak area ratio)来检 测巴氏水肿胎儿。结果：30例拟诊巴氏水肿胎儿的小片段cffDNA扩增结果提示， 巴氏水肿胎儿两种产物锋面积比远远1。而其他原因所致的水肿胎儿的cffDNA模 板扩增结果显示两种产物封面值比近似等于1。结论：通过荧光PCR和毛细管电 泳的方法，有望利用cffDNA进行巴氏水肿胎儿的无创性产前诊断。

作者：王谷仙 严璟 来源：人间 2016年21期