【保妇康栓微生物限度检查法的验证】微生物限度方法验证

保妇康栓微生物限度检查法的验证

【关键词】 微生物限度检查法；
验证试验；
薄膜过滤法；
抑菌；
回收率 ［abstract］ objective: to eliminate the bolt  unifem hong microbial limits test of the antimicrobial effect. method: to use membrane filtration method to test, test and calculation of recycling and recovery. results: the test for products of escherichia coli, staphylococcus aureus, candida albicans, bacillus subtilis, aspergillus niger, the recovery rates were 70 percent or more, membrane filtration method can meet the requirement. conclusion: the film filtration can eliminate drugs in antibacterial material interference. ［key words］ microbial limits test;
certification test;
membrane filtration；

antibacterial;
recovery rate 药品微生物限度检查法建立时应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法是否适合于该药品的细菌、霉菌 及酵母菌的测定和控制菌检查［1］。wwW.133229.COM若药品的组分或原检验 条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法和检查方法应重新验证［2，3］。

有些制剂有抑菌作用, 制备的供试液本身会影响微生物的生长，若不进行方法学 验证，所采用的方法不一定适合该供试品的微生物限度检查［4］。系统的方法 学验证可以避免因为选择方法不合理而造成漏检、误判，以保证结果的科学可靠。

1 材料 1.1 主要仪器、药品 stv3型无菌检查薄膜滤器（浙江宁海白石药检仪器厂），303as  2型数显 隔水式培养箱（上海浦东荣丰科学仪器公司），spx  25型生化培养箱（上海跃 进医疗器械厂）。保妇康栓（批号20060331,栓剂, 海南碧凯药业有限公司）。

1.2 培养基及稀释剂玫瑰红钠琼脂培养基 、营养琼脂培养基 、胆盐乳糖培养基、改良马丁琼 脂培养基、改良马丁液体培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化 钠琼脂培养基、营养肉汤均由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.3 验证试验用菌种 金黄色葡萄球菌 cmcc(b) 26 003、枯草芽孢杆菌 cmcc(b) 63 501、大肠埃 希菌cmcc(b) 44 102、 白色念珠菌cmcc(f) 98 001、 黑曲霉 cmcc(f)98 003、铜绿 假单胞菌cmcc（b）10 101，金黄色葡萄球菌cmcc（b）26 003、铜绿假单胞菌cmcc （b）10 101均由海南省药品检验所提供，以上菌种所用菌株均未超过5代。

2 方法与结果 2.1 菌液制备 （1）取经35～37 ℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草 芽孢杆菌的肉汤培养物1 ml加9 ml灭菌生理盐水，采用10倍递增稀释法，稀释至 10-5～10-7，控制细菌数约为50～100 cfu/ ml。（2）取经23～28 ℃培养18～24 h 的白色念珠菌液体培养物1 ml加9 ml灭菌生理盐水，采用10倍递增稀释法，稀释 至10-5～10-7，菌数约为50～100 cfu/ ml。（3） 取经23～28 ℃培养7 d的黑曲霉 菌斜面培养物，加3～5 ml灭菌生理盐水洗下霉菌孢子，采用管口带有薄无菌棉 花的毛细吸管吸出菌液，取1 ml 加9 ml灭菌生理盐水，逐管10倍稀释为10-4，菌 数约为50～100 cfu/ ml。

2.2 供试液的制备 称取本品10 g，溶于100 ml无菌ph 7.0氯化钠  蛋白胨缓冲液中，作为1∶10 的供试药液。

2.3 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 2.3.1 试验方法 取1∶10供试液10 ml，过滤，用ph 7.0氯化钠  蛋白胨缓 冲液冲洗2次，每张滤膜每次冲洗量为100 ml，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于 相应的培养基平板上，每种培养基至少制备一张滤膜，置规定温度中培养24～72 h。

2.3.2 冲洗量的验证 取1∶10供试液10 ml，过滤，分别用100、200、300 ml的ph 7.0氯化钠  蛋白胨缓冲液冲洗，最后一次冲洗液中加入1 ml金黄色葡萄球 菌的菌悬液，过滤后取出滤膜，菌面朝上贴于相应培养基平板上，培养24～72 h， 结果见表1。表1 冲洗量的验证 2.3.3 回收率测定 （1）试验组：取1∶10供试药液10 ml，照上述方法操 作,最后一次冲洗液中加入1 ml菌液,过滤后取出滤膜,分别菌面朝上贴于营养琼脂 平皿中30～35℃培养48 h观察结果，逐日点计菌落数，以48 h的菌落数报告。（2） 菌液组：测定每一菌株的试验菌液1 ml,依照试验组方法进行试验。（3）供试药 品对照组：不加菌液，其它操作同试验组，测定样品本底菌数。（4）稀释剂对 照组：取无菌ph 7.0氯化钠  蛋白胨缓冲液,按照试验组的冲洗量过滤,在最后一次 冲洗中逐一加入试验菌液1 ml, 过滤后取出滤膜, 其它操作同试验组。（5）回收 率计算公式：试验组的菌回收率(%)=（试验组菌落数均值-试品对照组菌落数均 值）/菌液组菌落数均值×100%，稀释剂对照组回收率(%)=稀释剂对照组菌落数 均值/菌液组菌落数均值×100%。

海南医学院学报 vol.15 no.1 feb.2009从表2结果可知,采用薄膜过滤法检验 保妇康栓供试品，人工污染5株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄 球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉的回收率均高于70%，故可采用薄膜 过滤法进行检验。表2 薄膜过滤法各试验菌回收率（%）(冲洗量：200 ml) 组别实验次数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲 霉试验组181918279752768280867438274928981稀释剂对照组 183798980712798677798238875839077 2.4 控制菌检查方法的验证 2.4.1 试验方法及菌液、供试液的制备 （1）试验方法采用薄膜过滤法［5］。

（2）菌液制备：取经37 ℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大 肠埃希菌的营养肉汤培养物1 ml加9 ml无菌生理盐水，采用10倍递增稀释法，稀 释至10-6，细菌数约为10～100 cfu/ ml。（3）供试液的制备：同“2.2项”下供试液 的制备。

2.4.2 验证方法 （1）试验组：① 分别取几份供试液10 ml过滤，冲洗， 取出一份滤膜接入100 ml的胆盐乳糖培养基中；
其中一份在最后一次冲洗液中加 入1 ml菌数约为10～100 cfu/ ml 的铜绿假单胞菌，过滤后，取出滤膜接入100 ml 胆盐乳糖培养基中作为阳性对照；
另取与供试液等量的稀释剂按薄膜过滤法操作后，取出接入100 ml胆盐乳糖培养基中作为阴性对照，35～37℃ 培养18～24 h， 取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养18～24 h，结果见表3。② 分别取几份供试液10 ml过滤，冲洗，取出一份滤膜接入100 ml 的营养肉汤培养基中；
其中一份在最后一次冲洗液中加入1 ml菌数约为10～100 cfu/ ml 的金黄色葡萄球菌，过滤后，取出滤膜接入100 ml营养肉汤培养基中作 为阳性对照；
另取与供试液等量的稀释剂按薄膜过滤法操作后，取出接入100 ml 营养肉汤培养基中作为阴性对照，35～37 ℃培养18～24 h，取上述培养物，划 线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养18～24 h，结果见表3。（2）阴 性对照组：
取100 ml的胆盐乳糖培养基和营养肉汤培养基，照试验组同法操作， 分别加入大肠埃希菌10～100 cfu/ ml作为阴性对照，35～37 ℃培养18 ～ 24 h， 取此培养物分别划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板和甘露醇氯化 钠琼脂培养基平板上，置35～37 ℃培养18～24 h，结果见表3。

从表3结果可知，试验组铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌生长良好，本品 对其没有抑菌作用；
阴性菌未检出，表明该检查方法的专属性良好，可用于保妇 康栓的控制菌检查。表3 控制菌检查结果（冲洗量200 ml） 注:“＋”代表反应阳 性，“－”代表反应阴性。

3 结论 药品要做微生物限度检查前,应该确认所选用的方法,需根据药品的性质选 用适宜的一种方法或几种方法进行验证,确认所选用的方法是否可行,所得结果是 否真实、可靠。

本试验结果可知，保妇康栓的微生物限度检查可采用薄膜过滤法［5］进 行,即取本品10 g溶于100 ml 的无菌ph 7.0氯化钠  蛋白胨缓冲液中，取1 ml薄膜 过滤,以0.1 %蛋白胨水冲洗, 冲洗量为200 ml。

保妇康栓本身具有抑菌作用, 制备的供试药液会影响微生物的生长，经微 生物限度检查法的验证试验证明，选用薄膜过滤法可消除药品中抑菌物质的干扰， 得到准确的测定结果。