【乳腺癌耐药蛋白基因在乳腺癌中的表达及其与化】 乳腺癌耐药了怎么办

乳腺癌耐药蛋白基因在乳腺癌中的表达及其与化

【关键词】 乳腺肿瘤/药物疗法;乳腺癌耐药蛋白基因;半定量逆转录一聚 合酶链反应 多药耐药是影响乳腺癌化疗效果的重要因素之一，乳腺癌耐药蛋白(bcrp) 是1998年被发现的又一与耐药有关的糖蛋白，其在肿瘤耐药中的作用日益受到关 注。www.133229.coM本研究应用半定量逆转录—聚合酶链反应(rt  pcr)的方法检 测60例行新辅助化疗患者乳腺癌组织的bcrp基因表达，并观察其与化疗疗效的关 系，现将结果报道如下。

1材料与方法 1  1病例选择60例均为我院乳腺科2005~2008年住院行新辅助化疗的 女性乳腺癌患者,年龄30～65岁,中位年龄45岁。所有病例均经巴德枪粗针穿刺病 理确诊，均未接受过手术、放疗、化疗、内分泌治疗等抗癌治疗的原发乳腺癌患 者，并排除其他肿瘤。按照国际抗癌联盟(uicc)2002年tnm分期标准:ⅱ期27例， ⅲ期29例，ⅳ期4例。其中ⅳ期患者中1例胸椎转移，1例胸骨转移，1例肺转移， 1例肝转移(以临床ct/mr诊断为标准)。按照世界卫生组织(who)乳腺肿瘤组织学类 型分类标准:浸润性导管癌53例，浸润性小叶癌3例，黏液腺癌3例，髓样癌1例。

1  2试剂trizol试剂(invitrogen公司)，takars rna pcr kit(amv)ver  3  0 试剂盒(大连宝生物有限公司)，depc(大连宝生物有限公司)。引物光探针合成(上 海生工公司)：bcrp上游引物序列为5   ttaggattgaagccaaagg  3’,下游引物序列为5   taggcaattgtgaggaaaata  3’;β  actin上游引物序列为5   ctcgcgc tactctctctttc  3’，下游引物序列为5   catgtctcgatcccacttaac  3’。

1  3药物疗效判断标准根据化疗前bcrp基因表达情况，将60例患者分 为阳性组及阴性组，并采用cef方案[环磷酰胺0  5 g/m2 ,第1天(d1)+法玛新80 mg/m2 ,d1+5  氟脲嘧啶0  5 g/m2 ,d1]。21d为1个疗程，3个疗程后，按who实体 瘤的近期疗效标准评定疗效，分为完全缓解(cr)、部分缓解(pr)、疾病稳定(sd)、 进展(pd)。

1  4乳腺癌耐药基因的检测采用半定量逆转录—聚合酶链反应 (rt  pcr)的方法。

1  4  1rna提取肿瘤组织总rna提取采用异硫氰酸胍、酚、氯仿抽提“一 步法”[1]。紫外光分光光度计准确定量，沉淀于无rnaase水中，-80℃保存备用。

1  4  2cdna合成按one step rt  pcr 试剂盒(日本takara 公司) 说明书 配制rt  pcr 反应体系10μl, 含总rna 1μg、mgcl2 2μl、10倍rt buffer 1μl、dntp液体 1μl、rnase抑制酶 0  25μl、oligo  dt 0  5μl、amv酶 0  5μl、加入depc处理水至 10μl，30℃、10min，42℃、30min，99℃、5min，5℃、5min。

1  4  3pcr反应rt产物10μl，5倍pcr buffer 10μl，ex taq酶 0  25μl，bcrp 上、下游引物1μl(12  5pmol)，β  actin上、下游引物1μl(12  5pmol)，灭菌蒸馏 水27  75μl置于pcr扩增仪上，反应条件为94℃、2min 预变性，然后按94℃、40s， 55℃、60s，72℃、60s，共35个循环;72℃延伸10min。

1  4  4电泳取10μl pcr产物进行电泳，用20g/l琼脂糖凝胶电泳，eb染 色，以5v/cm电泳60min，经凝胶成像分析系统分析扫描定量并照相，以 bcrp/β2  mg的比值作为bcrp基因的相对表达水平。bcrp基因电泳结果有2个条带， 即bcrp 446bp及β  actin 330bp，以bcrp/β  actin的比值0  5为bcrp表达阴性，以 bcrp/β  actin的比值≥0  5为bcrp表达阳性[1]。

1  5统计学方法将实验数据输入spss 10  0统计软件包，采用χ2检验 分析阳性表达率，p0  05为具有统计学意义。

2结果 2  1乳腺组织中bcrp mrna表达乳腺组织中bcrp mrna表达的pcr产物凝胶电泳结果见图1。60例原发乳腺癌中bcrp基因阳性表达17例，阳性表达率为 28  3%(17/60)。

① 为marker dl  2000(dna分子量标准);②为bcrp mrna表达阴性;③为 bcrp mrna表达阳性 2  2bcrp基因表达与化疗疗效的关系表1结果显示，60例原发乳腺癌 患者中，bcrp基因阳性组患者总缓解11例，缓解率(64  7%)明显低于阴性组 (93  0%)，两组比较差异有显著性意义(p0  05)。表12组疗效比较 3讨论 bcrp是与多药耐药相关的膜转运蛋白，主要参与膜内、外药物转运而 改变药物在胞内的分布，在转运细胞毒化疗药物中以“半—转运”方式排出药物， 属于atp转运蛋白的超家族成员。bcrp基因在乳腺癌中的表达情况报道结果尚不一 致。本研究结果显示，60例乳腺癌中bcrp基因阳性表达17例，阳性表达率为28  3%。

与kanzaki等[2]采用pt  pcr方法检测43例初治乳腺癌患者手术切除肿瘤组织中发 现9例标本有较高水平的bcrp基因表达基本相近。

肿瘤耐药是多基因参与的结果，了解耐药基因的表达，对于选择合适 的治疗方案和实施有效的逆转措施具有重要的指导意义。bcrp是abc转运子编码 基因家族的成员之一，该基因产物的过表达常伴有乳腺癌化疗耐药，并呈现出多 药耐药性。耐药蛋白bcrp的底物广泛，bcrp表现型的耐药细胞对包括蒽环类药物、 拓扑替肯(tpt)、氨甲蝶呤(mtx)、vp16等许多抗肿瘤药物耐药[3]。本研究结果表明， bcrp mrna高表达者对cef方案化疗效果较差，bcrp mrna的表达水平可以作为预测 化疗效果的一个重要参考指标。因此，本项目研究的完成对临床合理地制定化疗 方案、选择化疗药物的种类、避免不必要的化疗药物副作用，具有一定的指导意 义。