抗卵巢癌的药 漆黄素抗卵巢癌的体内外作用讨论

漆黄素抗卵巢癌的体内外作用讨论

漆黄素(3，3，4，7-四羟基黄酮)是黄酮类化合物的一种，属于多酚类化合物，是 从黄栌等植物茎叶中提炼出来的食用性黄酮成分，广泛存在于各种水果蔬菜中如 苹果、草莓、柿子、葡萄、洋葱和黄瓜等。目前，国内外研究发现漆黄素在各类 癌症中表现出抗氧化、抗炎、抗细胞增殖、防肿瘤转移、抗血管生成、抗过敏、 抗血小板等多种作用。本实验以不同浓度梯度的漆黄素作用卵巢癌细胞株，同时 建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型，观察肿瘤细胞的增殖、凋亡和移植瘤的生长情况， 旨在探索漆黄素对卵巢癌生长抑制、促凋亡的可能机制，为漆黄素应用于卵巢癌 的治疗提供理论依据。

1 材料和方法 1.1 实验材料 漆黄素〔(纯度98%)，四川大学华西药学院〕;人卵巢癌细胞株SKOV3(四 川大学华西第二医院妇科肿瘤生物治疗实验室);15只4～6周龄无胸腺雌性裸鼠 (四川大学实验动物中心);DMEM 培养基、胎牛血清和胰酶(Gibico BRL 公司);
噻唑兰(MTT，Sigma公司);流式细胞分析仪(BeckmanCoulter公司)。日立H-600IV 型透射电镜(四川大学华西基础医学与法医学院);酶标仪(美国BIORAD公司，型号 680);倒置生物显微镜(重庆光电仪器有限公司，型号XDS-1B);细胞培养箱〔日本 SANYO公司，型号MCO-18M(UV)〕;标准超净化工作台(美国AIRTECH公司，型 号SW-CJ-2FD)。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、体积分数5%CO2细胞培养箱 中培养人卵巢癌细胞株SKOV3，细胞长满培养瓶底70%～80%后，用胰酶消化、收集、离心、传代。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 透射电镜(TEM)观察卵巢癌细胞内的超微结构 在生长状态良好的人卵巢癌细胞株SKOV3中加入漆黄素100mol/L作用细 胞48h，然后将细胞用胰酶消化后收集于2mL离心管，2 000r/min离心15min，弃 去上清液。用吸管沿离心管壁缓慢加入0.5%戊二醛固定液2mL，在4℃环境中静 置10min。13 000r/min离心10min，弃去上清液。沿离心管壁缓慢加入3%戊二醛 固定液2mL固定。最后经1%四氧化锇固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，半薄 切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色。日立H-600Ⅳ型透射电 镜将细胞放大8 000倍观察。

1.2.3 MTT法检测卵巢癌细胞的增殖情况 将生长状态良好的人卵巢癌细胞株SKOV3用胰酶消化后，用含10%胎牛血 清的DMEM 高糖培养基将细胞配制成单细胞悬液，按每孔200L的体积接种于96 孔板，细胞密度为每孔5103 个。每组设6个复孔，同时设立只加培养基的空白组。

在37℃、体积分数5%CO2孵箱中培养，孵育24h贴壁后，更换培养基，并分别以 漆黄素不同浓度梯度〔0(对照组)、25、50、100、200和400mol/L〕进行干预。混 合孵育24～72h，待测孔内加入事先配制好的MTT溶液(5mg/mL)20L，在培养箱 (37℃，体积分数5%CO2)中继续培养4h，终止培养后，小心吸取孔内培养上清液， 每孔再加入二甲基亚砜(DMSO)150L，避光室温低速震荡10min，使结晶颗粒充 分溶解。最后选择490nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值，记 录结果，并计算细胞抑制率，抑制率(%)=(1-加药组A 值/对照组A 组)100%。然 后经改良寇式法计算50%生长抑制浓度(IC50)。

1.2.4 流式细胞术检测卵巢癌细胞的凋亡 当卵巢癌细胞铺满瓶底70%～80%时，予以25、50、100、200和400mol/L 漆 黄素处理48h。用不含EDTA 的胰酶消化3 min，离心(2 000r/min，5min)收集。用 含10%胎牛血清的PBS洗涤细胞2次(2 000r/min，离心5min)，收集5105 细胞，加 入500L Binding Buffer悬浮细胞。然后加入5L AnnexinⅤ-FITC 混匀后，再加入5 LPropidium Iodide(PI)混匀。室温、避光、反应5～15min后，样本通过流式细胞 仪计数1.5104 细胞进行分类分析。

1.2.5 漆黄素对卵巢癌移植瘤的抑制作用1.2.5.1 试剂配制 将漆黄素溶解于聚乙二醇400(PEG400)∶DMSO=7∶3的混合溶剂中，配制 质量浓度80mg/mL，使用Millipore 0.22m滤器过滤除菌，实验前1h制备好。

1.2.5.2 实验分组及处理 将生长状态良好的人卵巢癌SKOV3细胞消化、收集、离心，用PBS缓冲溶 液重悬细胞后计数，调节细胞浓度为5107 mL-1，以0.1mL注射于无胸腺雌性裸鼠 的双侧背部皮下。将15只无胸腺雌性裸鼠随机分为3组(n=5)：A组(对照组)，注 射PEG400+DMSO;B组，注射PEG400+DMSO+漆黄素(200mg/kg);C组，注射 PEG400+DMSO+漆黄素(400mg/kg)。于注射人卵巢癌细胞SKOV3一周后开始漆 黄素干预，漆黄素给药方式为瘤体周围皮下注射，每周连续给药5d，休息2d，每 次注射药物体积0.1mL，共持续2周。对照组注射相同体积的PEG400+DMSO混合 液，给药方式相同。所有实验步骤均遵守中国科学院上海实验动物研究中心制定 的实验动物指南。

1.2.5.3 移植瘤体积和质量的测量 裸鼠接种人卵巢癌SKOV3细胞后，从第1周周末开始，每周测量两次肿瘤 组织体积。3周后用CO2处死裸鼠，解剖并取下瘤体组织，测量离体肿瘤组织的 体积[13]和质量，拍照记录。取下的肿瘤组织消化并裂解细胞，用以检测蛋白表 达改变。

1.2.5.4 Western blot检测 移植瘤中Bcl-2、Bax及聚腺苷二磷酸核糖多聚酶(PARP)蛋白的表达 液氮 条件下将移植瘤组织研磨成粉末，加入细胞裂解液(7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲， 40 g/LCHAPS，65 mmol/L DTT，体积分数0.002Biolyte)并超声，室温下静置20min， 然后在4℃下以13 000r/min离心1h，取上清液用蛋白定量分析试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)定量，余下样品-70℃保存。次日用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋 白，PVDF膜转膜，经封闭、敷育抗体，洗膜，暗室显色等步骤。

1.3 统计学方法 百分率的比较用卡方检验;多组间的比较，先进行方差齐性检验，再进行 单因素方差分析，组间两两比较采用Students t检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 漆黄素对SKOV3细胞超微结构的影响 100mol/L漆黄素处理人卵巢癌SKOV3细胞株48h后，电镜下细胞超微结构。

未处理的卵巢癌细胞具有较大的细胞核。经漆黄素处理后，在核膜下染色质形成 界限清楚、均匀致密的团块;核仁的改变包括核仁周围散在的染色质凝结成异源 性颗粒，位于核的中心;此时，胞浆的改变包括细胞骨架细丝的密集、核蛋白体 颗粒成群，而在分泌细胞中，则有粗面内质网的再排列而形成同心圆状;在胞膜 下可见较多光面内质网形成的透亮空泡，并可与浆膜融合。

2.2 细胞增殖抑制率结果 不同浓度梯度的漆黄素作用人卵巢癌细胞株SKOV3 24～72h，结果均显示 漆黄素对SKOV3细胞的生长呈现抑制作用。随漆黄素浓度的增加，漆黄素对细 胞的增殖抑制率增大，即漆黄素对细胞的抑制作用呈浓度依赖性。漆黄素IC50 值为132mol/L。随漆黄素作用时间延长，同等浓度下细胞抑制率趋于稳定，3个 时点间差异无统计学意义。

2.3 细胞凋亡结果 在流式细胞术双参数散点图中，左上象限为坏死细胞;左下象限显示活细 胞，为AnnexinⅤ-/PI-;右上象限是凋亡晚期细胞或凋亡继发性坏死细胞，为 AnnexinⅤ+/PI+;而右下象限为早期凋亡细胞，为AnnexinⅤ+/PI-。流式细胞术 AnnexinⅤ/PI染色结果显示，与对照组相比，各漆黄素浓度组细胞总凋亡率(早期 凋亡率+晚期凋亡率)均升高(P 均0.05)，且400mol/L浓度组mol/L浓度组mol/L浓 度组(P0.05)。而漆黄素浓度25、50、100mol/L浓度组间的细胞凋亡率则无明显变 化(P0.05)。

2.4 动物实验结果 2.4.1 裸鼠的基本情况 全部裸鼠在接种人卵巢癌细胞株SKOV3后，均在接种部位皮下出现约麦 粒般大小的肿瘤;药物干预期间裸鼠未出现死亡。

2.4.2 移植瘤体积和质量的变化结果显示，药物干预组随着时间的延长，肿瘤体积与对照组的差异增大， 高浓度(400mg/kg)漆黄素干预组肿瘤体积抑制最为明显。裸鼠处死后，高浓度 (400mg/kg)漆黄素干预组肿瘤的平均质量为(52524)mg，而低浓度(200mg/kg)漆黄 素干预组肿瘤的平均质量为(87837)mg，均小于对照组〔(1 08642)mg，P0.05〕， 并且高浓度(400mg/kg)漆黄素干预组肿瘤质量低于低浓度(200mg/kg)漆黄素干预 组(P0.05)。

2.4.3 移植瘤中Bcl-2、Bax等凋亡相关因子的表达 与对照组相比，经漆黄素治疗后的裸鼠移植瘤组织中Bcl-2的表达有所降 低，而Bax蛋白的表达有所升高，PARP蛋白出现明显剪切，特别是高浓度(400 mg/kg)漆黄素干预组变化较明显。

3 讨论 手术辅以术后化疗可使卵巢癌的复发率下降28%，死亡率下降34%。尽管 如此，卵巢癌的治疗结局依然不尽如人意，为提高卵巢癌尤其是中晚期卵巢癌患 者的生存率及生存质量，寻找有效、安全、无毒或低毒性的新型药显得尤为重要。

黄酮类化合物广泛存在于各种植物色素中，且被人类大量食用。目前，国内外研 究发现漆黄素在各类癌症中均表现出抗癌作用，漆黄素对结肠癌细胞的研究发现， 其可通过抑制环氧化酶-2(COX-2)和Wnt/表皮生长因子受体/核因子 -B(Wnt/EGFR/NF-B)信号通路，诱导细胞凋亡和抑制癌细胞的生长。漆黄素对前 列腺癌的研究发现漆黄素呈时间-剂量依赖性的抑制细胞生长并抑制DNA 合成， 同时，漆黄素通过调节线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡。在一项对宫颈癌的研究 中显示漆黄素调控凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)、细胞外信号调节激酶(ERK)和 COX-2 的分子机制来诱导宫颈癌HeLa细胞的凋亡及抑制细胞生长。漆黄素对人 肺癌细胞株A549的研究发现，漆黄素可降低肿瘤细胞存活率和克隆形成率，增 加人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白酶同源的基因(PTEN)表达，抑制哺 乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达。漆黄素在胰腺癌中抑制死亡受体(DR3) 介导的NF-B活化，降低基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达，抑制细胞生长，诱导凋 亡。漆黄素是否具有抗卵巢癌作用，国内外文献报道均较少。本研究通过设计体 内、体外两部分实验，应用现有成熟生物效应检测技术，观察漆黄素对卵巢癌细 胞的作用，探究其作用机制，为寻找防治卵巢癌的有效低毒药物及临床探索提供 有效的实验依据。

肿瘤的发生主要是由于细胞增殖的调节失控，恶性肿瘤的发生及发展还与肿瘤细胞凋亡失控密切相关。目前，细胞凋亡对肿瘤治疗作用的研究已成为肿瘤 研究的热点之一。本研究首先通过电镜观察漆黄素作用后的人卵巢癌细胞株 SKOV3，发现细胞结构发生了凋亡的变化，进而选择MTT实验，证实漆黄素明 显抑制卵巢癌细胞的增殖，且增殖抑制作用呈浓度依赖性。这一结果与文献报道 的漆黄素对其它肿瘤的抑制作用结果相一致。研究表明漆黄素能诱导各种肿瘤细 胞凋亡，从而发挥对肿瘤的抑制作用，本研究通过流式细胞术也证实漆黄素能够 诱导卵巢癌细胞的凋亡。本研究还建立了卵巢癌裸鼠移植瘤模型，探索漆黄素对 裸鼠移植瘤的抑制作用。结果显示，漆黄素干预组移植瘤的体积和质量均低于对 照组，且高浓度(400mg/kg)漆黄素干预组较低浓度(200mg/kg)组更明显。这与漆 黄素对前列腺癌移植瘤的抑制作用一致。此外，另有研究表明漆黄素在对卵巢癌 的治疗中是有效且安全的。

细胞凋亡是细胞的程序性死亡，它是由一类基因介导的细胞自主性死亡过 程，表现为细胞膜完整，细胞体积变小，细胞核固缩，晚期可见凋亡小体。恢复 和激发肿瘤细胞的凋亡能力并诱导细胞凋亡是肿瘤防治的有效方法。为进一步探 讨漆黄素诱导裸鼠卵巢癌细胞的凋亡作用，本研究检测肿瘤组织中Bcl-2和Bax蛋 白的表达水平，结果显示，漆黄素干预组Bax蛋白表达高于对照组，Bcl-2表达明 显低于对照组，且高浓度漆黄素干预组的表达水平变化更明显。作为保护因子的 Bcl-2活性的降低和凋亡前蛋白Bax的激活使细胞更易损伤，从而促进细胞凋亡。

而PARP被剪切则被认为是细胞凋亡的一个重要指标。动物实验进一步证实了漆 黄素作为潜在抗瘤药物的有效性和可行性。这与近期的研究发现漆黄素对前列腺 癌、结直肠癌、膀胱癌等各种肿瘤均有抗细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用一致。

综上，本研究发现漆黄素在体内外均发挥了人对卵巢癌SKOV3细胞的抗 肿瘤作用，抑制了卵巢癌的发生发展，因此，漆黄素有望成为一种预防和治疗卵 巢癌的安全有效的天然药物。本课题组下一步拟扩大并细化检测漆黄素在诱导卵 巢癌细胞凋亡信号通路中各蛋白表达水平改变，增加体内实验给药方式如血管内、 腹腔内给药，探究药物体内作用机制及其安全性评估，为准备开展漆黄素临床药 理学实验积累更多数据。