酶联斑点试验_建立快速检测麻疹病毒IgG抗体酶联斑点法及效果

建立快速检测麻疹病毒IgG抗体酶联斑点法及效果

[方法] 采 用硝酸纤维素膜作固相载体，促使抗原、抗体在膜上进行反应时处于高浓度状态， 加快反应速度。

[结果] 检测48例血清中麻疹病毒IgG抗体，结果和板上ELISA 法一致，特异性、灵敏性、重复性好，判断直观。

[结论] 适合基层推广应用。

关键词：
酶联斑点法;
麻疹病毒;
抗体IgG 中图分类号：
R 373.1 文献标识码：
B 文章编号：
1007-2705(2000)05-0043-02 我们采用对蛋白分子具有很强吸附能力的硝酸纤维素膜作固相载体， 用麻疹病毒和羊抗人IgG抗体建立酶联斑点法，检测人血清中麻疹IgG抗体。并用 该法与板上ELISA法同时检测48人血清标本，进行效果评价，现将结果报道如下：
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 硝酸纤维素膜：
孔径为0.45 μm。

1.1.2 麻疹病毒抗原、羊抗人IgG抗体：
由中国预防医学科学院病毒 研究所提供。

1.1.3 溶液：
TBS(0.02 mol/L，pH 7.5)，三羟甲基氨基甲烷2.42 g， NaCl 29.0 g，蒸馏水1000 ml，HCl pH 7.5，TBST、TBS溶液含吐温-20 0.5%。

1.1.4 底物：
3-3-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)5 mg，TBST 25 ml，临 用前加 10 μl 30% H2O2。

1.1.5 血清标本：
采自福州铁路小学7岁年龄组学生计48人，置-20℃ 保存备用。

1.2 方法 1.2.1 酶联斑点法：
反应膜的制备：将0.45 μm硝酸纤维素膜裁成0.5cm×1 cm大小的膜片，用pH 7.5的TBS浸泡10 min，取出烘干，将包被用的麻疹 病毒抗原2 μl点加于膜片的中央，37℃干燥10 min，浸泡于含10%小牛血清的TBS 中，37℃封闭1 h，取出用TBST洗涤1次，37℃干燥20 min，4℃保存备用。

血清标本制备：将待测血清用TBS稀释成1∶200，然后按待测效价稀 释度稀释。测定方法：取已包被的膜片，按血清序号编号，每个稀释度编1张膜 片号，置入U型微量板孔中，每孔1张，加待测血清100 μl，羊抗人IgG酶标抗体 100 μl，37℃温育1 h，取出膜片，用TBST洗涤5次，每次1～2 min，置于底物显 色液中，避 基金项目：
该项目为上海铁路局立项课题。

光显色5～15 min，肉 眼可见棕色斑点为止，加蒸馏水终止反应。

结果判定：在膜片中央斑点区显示棕色圆点，按颜色深浅判为  、  、  、+。

 为强阳性，+为弱阳性。

每次试验设1份阳性对照，测IgG不设阴性对照。

1.2.2 板上ELISA法：
用pH 9.6，0.05 mol/L碳酸盐缓冲液分别将麻 疹病毒抗原和对照细胞抗原稀释至1∶20，每份血清包被病毒抗原4孔和细胞抗原 4孔，每孔100 μl置4℃过夜，次日弃抗原液，用NS-T洗涤3次。

加待测血清：用2%小牛血清NS-T稀释待测血清，1∶100～1∶1 600 连续稀释成4个稀释度后加入对应的病毒抗原孔和细胞抗原孔，每孔100 μl置37℃ 温育2 h，弃血清用NS-T洗涤3次，拍干。

加抗人IgG酶标记物：每孔100 μl，置37℃温育1.5～2 h，弃酶标记物， 用NS-T洗涤3次，拍干。

加底物液：OPD-H2O2每孔100 μl，避光，置37℃温育5～15 min， 细胞抗原未显色，病毒抗原孔显色为止，每孔加2 mol/L硫酸50 μl，终止反应。

结果判定：用空白孔调零，逐孔测定OD值，同一滴度的1份血清以病 毒抗原孔OD值与对照抗原孔之比为P/N值，P/N值≥2.1为阳性。

48孔板每块只能测6份血清标本，每次试验设1份阳性对照，不设阴性 对照。2 结果 2.1 包被麻疹病毒抗原和羊抗人IgG酶标抗体最适浓度的选择 经 方阵滴定，用与酶联斑点法麻疹病毒抗原最适浓度为1∶8，羊抗人IgG酶标抗体 最适浓度为1∶20。

2.2 特异性试验 取风疹病毒IgG抗体，风湿因子RF阳性、麻疹IgG 抗体阴性的血清，用测定麻疹病毒IgG抗体酶联斑点法检测，结果均为阴性。

2.3 敏感性试验 用酶联斑点法和板上ELISA法同时检测48份血清 中麻疹病毒IgG抗体，阳性率分别为97.9%(47/48)和91.7%(44/48)，两法符合率为 95.7%，经配对检验P0.05，两法无显著性差异。两法检测麻疹病毒IgG抗体效价 分布情况见表1。

表1 两种检测法检测麻疹病毒IgG抗体效价分布情况 检测法 检测 人数 1∶200 1∶200 1∶400 1∶800 1∶1600 酶联斑点法 48 1 4 6 10 27 板上ELISA法 48 4 3 7 9 24 2.4 重复性试验 用酶联斑点法对6份麻疹病毒IgG抗体阳性血清及 2份阴性血清，分别于间隔1、3、6个月重复检测麻疹病毒IgG抗体效价，结果基 本一致。

2.5 保存试验 将包被好的纤维素膜置4℃干燥存放，分别间隔1、3、 6个月取出，每次同时测定相同的6份麻疹IgG抗体阳性标本，将检测结果进行比 较，除存放6个月的膜片其检测结果斑点显色降一个加号外，其它无明显变化。

3 讨论 目前，测定人血清中麻疹病毒IgG抗体主要采用血凝抑制试验和板上 ELISA法，但两法均有缺点。血凝抑制试验操作繁锁，易造成交叉感染，板上 ELISA法对零散标本检测均需设阴、阳性对照，提高了检测成本。

我们采用具有强吸附蛋白分子性能的硝酸纤维素膜作固相载体，麻疹病毒抗原和羊抗人IgG酶标抗体建立的酶联斑点法，检测人血清中麻疹IgG抗体， 促使抗原和抗体在膜上反应时处于高浓度状态，加快了反应速度，达到了快速检 测的目的。

特异性试验显示，对麻疹IgG抗体有交叉免疫反应的风湿因子阳性血 清和风疹病毒IgG抗体的检测结果均为阴性。与板上ELISA法同时检测48份人血 清中麻疹IgG抗体，阳性符合率为95.7%，经配对检验P=∑Pi=0.0830.05，两法无 显著性差异，说明该法具有ELISA法相似的特异性。酶联斑点法全程检测时间为 1.5～2.0 h，加底物液5～15 min，阳性标本即可在斑点区内观察到呈棕色圆点， 结果判断直观，缩短了时间,减少了工作量。

稳定性试验表明，采用硝酸纤维素膜作固相载体，不但具有强吸附蛋 白分子的性能，且包被抗原后4℃干燥保存6个月，仍保持抗原的免疫活性不变。

分别于4℃干燥保存1、3、6个月取出同时检测，6份阳性标本结果均一致。

综上所述，我们建立的快速检测麻疹IgG抗体酶联斑点法，操作简便， 具有特异性、敏感性、重复性好、结果判断直观等优点，同时还可以进行定性或 定量检测，尤宜适用卫生防疫站作麻疹疫苗免疫后血清学效果评价及血清流行病 学调查，具有实用价值及推广应用。