染色体微阵列检测 [组织微阵列方法检测CD31、CD105、v-WF、PCNA在肝癌组]

组织微阵列方法检测CD31、CD105、v-WF、PCNA在肝癌组

【关键词】 肝肿瘤 新生血管形成是肿瘤生长、转移的前提，目前，作为多种肿瘤预后标志的 肿瘤组织微血管密度（microvessel density，mvd）受到广泛关注[1]。

WWW.133229.coM通过染色内皮细胞标志分子反映肿瘤血管是目前常用的技术 手段。研究表明，不同内皮标志分子反映肿瘤血管能力并不相同，与临床参数关 联亦存在差异；
同一内皮标志分子在不同肿瘤中，也可能具有不同的意义[2]。

因而，研究不同肿瘤的内皮细胞标志分子与肿瘤生物学行为的关联，对选择有效 反映肿瘤组织微血管的内皮标志分子有指导意义。血管播散为肝癌的主要转移形 式，不同血管标志分子，如cd31、cd105、v-wf与肝癌生物学行为是否存在关联 尚不明晰。组织微阵列是快速、均匀检测众多样本蛋白表达的技术[3]。我们采 用组织微阵列技术研究了mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf及pcna在38例肝癌标 本中的表达，初步探讨它们表达与肝癌临床病理参数之间的关联性。

1 材料与方法 38例肝癌根治性切除组织标本，为我院1999~2004年收治的患者。平均年 龄64岁，女性7例，男性31例。平均肿瘤大小6.6cm，其中13例小于3cm，38例患 者中，丙型肝炎感染者27例，乙型肝炎者6例。新鲜组织标本10%福尔马林固定，石蜡包埋。

1.1 肝癌组织微阵列的构建 应用tissue arrayer(beecher instvumeuts znc)构建肝癌组织微阵列，操作按说 明书进行，直径为2mm。在he切片上选择合适的肿瘤区域，避免坏死区域。每例 组织，分别选择肿瘤中心部位、肿瘤与肝组织交界部位及残留非癌肝组织部位， 各例组织制作组织学芯片。切取4μm切片供he染色和免疫组织化学检测用。

1.2 cd31、cd105、v-wf及pcna免疫组织化学染色 系列组织微阵列分别与cd31、cd105、v-wf及pcna单克隆抗体（dako， denmark）进行免疫组织化学染色。免疫组化sp法，选择pbs作为阴性对照。

1.3 结果判定 1.3.1 mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf表达 微血管密度(mvd) 测定参照weidner[4]的微血管计数方法：首先，于低倍 镜(×40) 下观察全部视野，选择3 个富含管组织的“热点”区，即棕黄染色密度最 高的区域。然后，在高倍镜(×400)下双盲法计数微血管。呈现单个或聚集在一起 的数个被染为棕黄色或棕褐色的内皮细胞，独立于邻近的微血管、肿瘤细胞或其 他结缔组织，作为1个微血管计数，计数3个视野，取其均值作为mvd。管腔大于 8 个红细胞直径或管壁带有肌层的大血管不作为新生血管计数。

1.3.2 pcna表达 核染色阳性细胞与计数细胞之比称为pcna阳性细胞率：＜1%为0；
1%~20% 为1；
21%~50%为2；
＞50%为3。2与3为pcna高表达。

1.4 cd31及pcna的免疫荧光双染色 组织微阵列二甲苯脱蜡，柠檬酸缓冲液加热修复抗原。4℃ 1∶50稀释的 鼠抗人pcna单克隆抗体孵育18h。pbs 冲洗5min，2次。然后与1∶200稀释的共轭 联连fitc的免抗鼠igg抗体（dako denmark）闭光37℃孵育30min[5]，pbs冲洗，柠 檬酸缓冲液加热15min，pbs冲洗。然后组织微阵列与1∶40稀释的鼠抗人单克隆 抗体37℃孵育1h，pbs冲洗，再与1∶200稀释的共轭联连cy3的免抗鼠单抗igg 37℃ 孵育30min；
pbs冲洗5min，2次。1.5 统计学处理 利用t检验与χ2检验分析患者临床及病理参数与mvd-cd31、mvd-cd105、 mvd-v-wf及pcna表达的相关性。利用 systat softwave (version 10.2)进行统计学分 析。p值小于0.05具有统计学意义。

2 结 果 2.1 cd31、cd105、v-wf、pcna免疫组织化学染色 ⑴cd31、cd105、v-wf免疫组织化学染色 cd31在上皮细胞的胞浆/胞膜表达，肝癌组织cd31免疫染色的血管多于癌 旁组织(图1)。cd105在上皮细胞的胞浆/胞膜表达，存在肝内转移的肝癌组织cd105 免疫染色的血管多于无肝内转移的肝癌组织（图2）。v-wf在上皮细胞的胞浆/胞 膜表达，肝癌组织v-wf免疫染色的血管数量与癌旁组织无差异。肝癌组织 mvd-cd31均值为48.5±29.7，而癌旁组织mvd-cd31均值为24.2±22.3，差异有显著 性（p＜0.01）；
mvd-cd105及mvd-v-wf在肝癌组织及癌旁组织分别为22.4±12.3和 15.9±11.7；
21.5±13.3和34.0±16.7，差异无显著性（表1）。

pcna在肝癌细胞核中表达，肝癌组织免疫染色显著多于癌旁组织(表1)。

⑵肝癌组织mvd-cd31，mvd-cd105 及mvd-v-wf与pcna表达的关系 pcna高表达的肝癌组织mvd-cd31均值（68.3±36.9）显著高于pcna低表达的 肝癌组织（37.9±30.9，p=0.012），mvd-cd105及mvd-v-wf与pcna表达无相关性（图 3）。

⑶存在肝内转移的肝癌组织及无肝内转移的肝癌组织的mvd-cd31， mvd-cd105及mvd-v-wf 存在肝内转移的肝癌组织mvd-cd105均值为28.4±19.4，而无肝内转移的肝 癌组织mvd-cd105均值为5.4±5.2，差异有显著性（p＜0.01）；
存在肝内转移的肝 癌组织及无肝内转移的肝癌组织mvd-cd31及mvd-v-wf分别为66.6±39.4和 44.9±32.9；
25.2±15.2和19.7±9.9，差异无显著性（表1）。

2.2 cd31及pcna在肝癌组织的免疫荧光双染色红色免疫荧光染色为cd31；
绿色免疫荧光染色为pcna。由图4可见，pcna 高表达的肝癌组织mcd-cd31分值高。

2.3 mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf及pcna表达与临床病理参数关系 mvd-cd105在存在肝内转移的肝癌表达显著增高（p＜0.01）；
而mvd-cd31、 mvd-v-wf及pcna表达与肝癌的肝内转移无相关性，它们与其它临床参数，如年龄、 性别、肿物大小、组织学分级、静脉浸润未见相关性（表1）。

3 讨 论 新生血管的启动是肿瘤演进过程中的早期事件，不仅为肿瘤组织提供营养 支持，也是肿瘤细胞进入循环系统的途径；
相对于成熟血管，肿瘤细胞更容易进 入基底膜发育不完全的新生血管[5]。研究证实，肿瘤新生血管的微血管密度与 进入循环系统的肿瘤细胞数量关系密切。目前，作为多种肿瘤预后标志的肿瘤组 织微血管密度受到广泛关注[1]。通过染色内皮细胞标志分子反映肿瘤血管是目 前常用的技术手段。研究表明，不同内皮标志分子反映肿瘤血管能力并不相同， 与临床参数关联亦存在差异；
同一内皮标志分子在不同肿瘤中，也可能具有不同 的意义[2]。因而，研究不同肿瘤的内皮细胞标志分子与肿瘤生物学行为的关联， 对选择有效反映肿瘤组织微血管的内皮标志分子有指导意义。cd31、cd105、v-wf 是常见的内皮细胞标志分子，研究显示，它们在肿瘤组织中表达的意义并不一致 [6,7]，它们与肝癌肝内转移是否存在关联尚不明晰。组织微阵列是快速、均匀检 测众多样本基因蛋白表达的技术[3]。我们采用组织微阵列技术研究mvd-cd31、 mvd-cd105、mvd-v-wf及pcna在38例肝癌标本中的表达，探讨它们与肝癌临床参 数的关联。

cd31作为内皮细胞标志，在非成熟的肿瘤血管及成熟血管中均有表达，相 对于其他内皮细胞标志，mvd-cd31更能精确反映肿瘤血管数量[8]。我们发现肝 癌组织mvd-cd31均值（48.5±29.7）显著高于癌旁组织，mvd频率与messerini l等[9] 研究接近（肝癌组织mvd-cd34的均值为54±13.8）。免疫荧光结果表明，肝癌组 织cd31阳性血管明显多于癌旁组织，癌旁组织cd31阳性血管主要存于门静脉周围。

pcna表达不同的肝癌组织mvd-cd31分值显著不同，两者呈正性相关；
cd31及pcna 免疫荧光双染色支持mvd-cd31分值高的癌组织，pcna高量表达。推测血管生成可 能促进肝癌细胞的增殖，可能与肝癌的发生有关。mvd-cd31可能成为反映肝癌增 殖状态的潜在指标。mvd-cd31与肝癌的肝内转移及其它临床参数，如年龄、性别、肿物大小、组织学分级、静脉浸润无相关性。

cd105可能通过tgf-βrⅰ和/或tgf-βrⅱ参与了tgf-β的信号传递过程，与血管 生成调控关系密切；
它仅表达于活性的内皮细胞，能更好反映恶性肿瘤的新生血 管形成[10]。mvd-cd105为乳腺癌、非小细胞肺癌、大肠癌独立的预后指标[11]， cd105有希望成为拮抗肿瘤血管生成治疗的有效靶位[12]。然而cd105在肝癌中表 达的相关研究尚未见报道。cd105表达与肝癌的肝内转移是否存在关联尚不明晰。

我们发现在肝癌组织和癌旁组织中mvd-cd105表达无差异，与pcna表达无相关 性；
mvd-cd105在存在肝内转移的肝癌组织中表达高于无肝内转移者，提示新生 血管生成可能促进肝癌肝内转移，mvd-cd105可能成为反映肝癌肝内转移的有意 义指标。我们发现cd105在癌旁组织显现弥散分布的染色方式，而癌旁组织多为 非正常组织，cd105在癌旁组织表达的意义有待进一步研究。mvd-cd105与其它临 床参数，如年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级、静脉浸润无相关性。

我们同时检测成熟血管标志物v-wf[7]，未发现mvd-v-wf与任何临床病理参 数相关联。提示v-wf阳性血管可能多为既存血管，因此在肝细胞癌中v-wf的检测 可能没有很大意义。

综上，我们应用组织微阵列检测肝癌组织mvd-cd31、mvd-cd105、mvd-v-wf 及pcna表达，初步探讨了它们与肝癌临床病理参数之间的关联，研究表明， mvd-cd31与肝癌增殖状态相关，mvd-cd105与肝癌肝内转移关系密切，是反映肝 癌恶性生物学行为相关指标，肿瘤新生血管可能在肝癌发生演进过程中起重要作 用。